某规模化牧场致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的鉴定及耐药性分析.docx

某规模化牧场致奶牛乳房炎金黄色葡萄

球菌的鉴定及耐药性分析

甘卫泽，李益涛，曹梦园，李傲寒，张莉，齐亚银

(1.昌吉州动物疾病预防控制中心，昌吉831100;2.石河子大学动物科技学院，

石河子832000;3.宁夏大学农学院，银川750000)

奶牛乳房炎会给牧场带来弃奶、用药残留、乳品质下降以及传染牛只淘汰等重

大损失，也可导致奶酪、凝乳等奶制品质量下降[1~3]。乳房炎的发生原因非

常复杂，一般可分为机械、物理、化学、微生物、饲养管理等多种因素单个或

共同作用产生。

导致奶牛乳房炎常见的病原菌主要有接触传染型病原菌(包括金黄色葡萄球菌、

无乳链球菌、牛支原体、牛棒状杆菌等),以及环境型病原菌(包括葡萄球菌、

大肠杆菌、克雷伯氏菌、原壁菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓隐秘杆菌、

粘质沙雷氏菌、酵母菌、肠球菌等)。其中金黄色葡萄球菌是最常见的一种细

菌，一旦感染很难彻底治疗，后期会转为慢性感染且耐药性极强，同时金黄色

葡萄球菌还可以危及人类健康，对公共食品卫生安全造成一定的威胁[4,5]。

为此，本研究为了查明某规模化牧场奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的感染及耐

药现状，采集隐性乳房炎源乳样，采用常规微生物学结合16SrRNA细菌鉴定

的方法，进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定，同时对其药敏表型及耐药基因进行

检测，以期为进一步制定有效防控措施提供科学指导意见。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1乳样来源

无菌采集812份乳样(经现场检测为隐性乳房炎),于4℃冷链保存运输至实

验室备用。

1.1.2主要试剂及药品

LB肉汤培养基、琼脂粉(上海生工生物工程股份有限公司);甘露醇高盐琼脂

(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司);革兰氏染色液(珠海贝索生物

技术有限公司);药敏纸片(头孢喹肟、环丙沙星、红霉素、阿奇霉素、青霉

素、卡那霉素、头孢噻吩、多西环素、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林钠、头

孢曲松，杭州滨和微生物试剂有限公司)。

1.2菌株的筛选及鉴定

1.2.1菌株的筛选及初步鉴定

无菌操作，将乳样接种于LB肉汤，37℃培养24h;然后采取连续划线的方法

接种在甘露醇高盐培养基上，37℃培养24h,观察菌落形态。挑取黄色且周围

有黄色环的菌落进行涂片、革兰氏染色、显微镜观察，同时将疑似菌株再次接

种于甘露醇高盐培养基上用于再一次鉴定和纯化。

1.2.2分离株的16SRNA鉴定

提取细菌DNA保存于-20℃备用。根据张蕾等[6]研究设计金黄色葡萄球菌1

6SRNA的引物，大小为1466bp,其引物序列：上游引物16S-

F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;下游引物16S-

R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。反应体系为20μL,其中2xEsTaq

MsterMix10μL,ddH2O7μL,上下游引物各1μL,细菌DNA模板1μL。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min,95℃变性45s,56℃退火45s,75℃延

伸1.5min;30个循环；72℃终延伸10min。反应结束后取8~10μL扩增产物

进行琼脂糖电泳检测。

1.3分离株的药物敏感性试验

1.3.1分离株的药敏表型检测

根据纸片法(Kirby-Baure法)进行药敏实验。将分离培养的金黄色葡萄球菌菌

落接种于肉汤培养基，于37℃培养至超过0.5麦氏单位，取出用盐水或肉汤调

节菌液至0.5麦氏单位，含菌量(1~2)×108CFU/mL。无菌操作：在MH琼

脂板上均匀涂菌，室温放置3~5min。用镊子取不同的药敏纸片，贴于琼脂表

面，不同药敏纸片的间距至少24mm,在平板贴6张药敏纸片。将粘贴完药敏

纸片的平板置35℃孵育18~24h后，测量抑菌圈直径。

参照美国临床实验室国家标准化管理委员会标准(CLSI2008)判定。

1.3.2耐药基因的检测

设计耐四环素tetK基因、庆大霉素-卡那霉素aacA-aphD基因、利福霉素类

rpoB基因、β-内酰胺类blaZ、norA基因、喹诺酮类sepA基因、消毒剂Smr-1、

adeB基因的引物。具体引物序列和所查阅文献如表1所示。

表1分离株耐药基因引物序列

具体反应程序如表2所示。

表2各耐药基因PCR体系

2结果与分析

2.1分离株的初步鉴定及形态学特征

奶样在甘露醇高盐培养基上的菌落形态为黄色并且周围有黄色圆圈；菌液划线

于甘露醇高盐的培养基上长出的菌落符合金黄色葡萄球菌的特性；金黄色葡萄

球菌经革兰氏染色后在显微镜下呈球型，排列呈葡萄串状，无芽孢、鞭毛，无

荚膜(图1)。

图1分离株葡萄球菌形态学特征

2.2PCR鉴定结果

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，产物大小