《抗体工程制药》课件.pptVIP

抗体工程制药;一.概述

;3;免疫球蛋白的结构;抗体的产生过程：

机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细胞被激活，增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。

;免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范围从150,000到950,000道尔顿。分五类：

IgG在血清中含量最高，达75~80%,是抗感染

的主要抗体;

IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为

五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的

第一个抗体；

IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参

与局部的免疫反应;

IgD在血清中含量很低;

IgE在血清含量最少。;动物血清中产生抗体的时间示意图;抗体研究的发展阶段：

①以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表,用抗原免疫动物来获得多克隆抗体。

②以1975年MilsteinKohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)为代表。

③以1994年Winter,创建了噬菌体抗体库(repertoireofantibodiesdisplayedonphages)技术,以基因工程方法制备抗体为代表。在此基础上发展成抗体工程。;多克隆抗体:

一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。

单克隆抗体(MonoclonalantibodyMcAb):

由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。

;多克隆抗体和单克隆抗体;McAb（Monoclonalantibody，单克隆抗体）：

将在体外不能长期传代的抗体产生细胞（如Balb/C小鼠的免疫脾细胞）与在体外能迅速增殖并带有抗药标记的骨髓瘤细胞（如小鼠的NS-1或SP2/0）在聚乙二醇（PEG）作用下融合，然后利用抗药性标记和经稀释法选出单个产生抗体的杂交瘤细胞，再用血清学方法证实其与抗原结合的特异性和亲和力。这样的杂交瘤细胞能长期传代同时分泌针对单一抗原上单一抗原表位的抗体，称为McAb（第二代抗体）。;二.单克隆抗体的制备;单克隆抗体制备过程图解;;;3.常用的骨髓瘤细胞系—SP2/0，P3.653细

胞，都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT)的缺乏株。

4.免疫方法:体外免疫法；体内免疫法

;;免疫佐剂（adjuvant)

（1）定义：先于抗原或同时与抗原混合注射机体

可增强抗原的免疫原性的物质。

（2）应用①弱免疫原性物质；

②免疫原剂量不足。

（3）佐剂种类

1)油性乳剂—弗氏佐剂（Freundadjuvant）

2)无机化合物

3)微生物及其产物

4)脂质体

5)细胞因子;二.细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

1.细胞融合的基本方法(PEG促融)

脾细胞骨髓瘤细胞(“永久”细胞)

(1×108)(2~3×107)

聚乙二醇(PEG)

37-40℃2mins

融合细胞（杂交瘤细胞）

用作细胞融合剂的聚乙二醇(PEG)一般选用MW4000，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2。可加入二甲基亚砜(DMSO)。;原理：

细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。;2、杂交瘤细胞的选择性培养

常用的选择培养基为HAT培养基。

次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、胸腺嘧啶(T)。

脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA,使杂交瘤细胞得以生长。

;HAT选择培养机制;HAT培养基：

H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料

;含有饲养细胞的24/96孔板内悬浮培养，2~3天换液一次(HAT的培养液7天内)