克隆操作中使用的工具酶.pptVIP

缺口01DNaseI02DNA聚合酶I03DNA聚合酶IdNTP*04缺口05缺口平移法制备DNA分子探针06Back07活性：5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性，无5`→3`外切酶活性。用途：填补或标记DNA的3`隐蔽末端；催化合成cDNA第二链；DNA序列测定3.2Klenow聚合酶同位素标记的EcoRI酶切末端EcoRI酶切末端α-32P-dATPBack显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90%；93℃反应2h残留活性60%；94℃反应2h残留活性40%。应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增；DNA序列测定。01Back023.3TaqDNA聚合酶逆转录酶(reversetranscriptase)：01又称RNA指导下的DNA聚合酶。02活性：035`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。043.4逆转录酶逆转录酶的活性用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。Back活性：5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。高浓度dNTP环竟下前者活性更强。应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端Back3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；（3）使双链DNA5`或3`突出末端变平末端。Back碱性磷酸酶末端转移酶T4多核苷酸激酶S1核酸酶Home4修饰酶2第二节核酸的分离纯化3第三节聚合酶链式反应（PCR）1第一节基因操作工具酶6第六节载体系统5第五节核酸的分子杂交4第四节凝胶电泳系统第十章分子生物学实验技术第一节基因操作工具酶基因工程操作中最常用的工具酶主要内容1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修饰酶5小结SUMMARYHome1限制性核酸内切酶1.1引言1.2命名1.3分类1.4活性及影响因素Home1.1引言—两个概念核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。按作用对象分:DNAaseRNAase按断裂核酸分子不同方式分：EndonucleaseExonuclease限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。01限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。02Back031.2命名命名原则：第一个字母（大写,斜体）：该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoRⅠ从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为EcoRⅠ，其中E代表属名（Escherichia)，co代表种名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表该菌株中首次分离到。Back1.3分类1.3.1Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ型限制性内切酶1.3.3Ⅲ型限制性内切酶Back功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；应用：不常用。01Back021.3.1Ⅰ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶01功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点3`端24-26bp处。应用：数量很少，无实际作用。01Back01反应特点：仅需Mg2+作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段