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数字PCR技术及应用

数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室，PCR扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。

1999年，美国学者KennethKinzler与BertVogelstein首次提出了“数字PCR(DigitalPCR，dPCR)”的概念，该技术实现了核酸拷贝数绝对定量的突破。其主要特点在于将目标分子分散入单个反应室中，使每个反应室中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，是实现数字PCR高灵敏度和高准确度的关键。

1技术原理

数字PCR主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，幵对其迚行PCR扩增，利用TaqMan?化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列，通过呈现两种信号类型的反应单元比例和数目进行统计学分析，实现样品的绝对定量。因此，数字PCR也称单分子PCR，其检测过程主要包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR反应前，将样品分散至几万个单元(反应室)中，使每个单元中只存在单个DNA分子。PCR扩增阶段的扩增程序、扩增体系与普通PCR幵没有什么不同。在荧光信号分析阶段，采用终端检测，是对每个反应单元的荧光信号迚行采集，然后直接计数或者借用泊松统计得到样品的原始浓度或含量(图1)。与实时荧光定量PCR不同的是，整个数字PCR过程不需要扩增标准曲线和看家基因，具有良好的准确度和重现性，可以实现真正意义上的绝对定量。

基于分液方式的不同，数字PCR主要分为3种：微流体数字PCR(MicrofluidicdigitalPCR，mdPCR)、微滴数字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)和芯片数字PCR(ChipdigitalPCR，cdPCR)。分别通过微流体通道、微液滴或微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应，其中mdPCR基于微流控技术，对DNA模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代；ddPCR技术，是相对成熟的数字PCR平台，利用油包水微滴生成技术，目前的仪器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系统和RainDance公司的RainDropTMdPCR系统，其中Bio-rad公司的dPCR系统利用油包水生成技术将含有核酸分子的反应体系生成20000个纳升级微滴，经PCR扩增后，微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测；cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上，目前的仪器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark?基因分析系统和LifeTechnologies公司的QuantStudio系统。利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增，实现绝对定量。

2数字PCR的优势

传统PCR技术是将目的基因经过PCR扩增循环，一个DNA分子模板复制成成千上万的子代双螺旋，然后用凝胶电泳进行检测。但是，凝胶电泳检测只能对扩增产物的分子大小进行判断，而无法推断出起始样品中DNA的含量，因此无法进行定量分析；实时荧光定量PCR可以进行绝对定量和相对定量，其中绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量，标准品可选择纯化的质粒DNA或体外合成的ssDNA等，相对定量通过内参等进行换算起始样品中DNA的相对含量。数字PCR是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第3代PCR技术，它不需要标准品，也不要制作标准曲线，即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。

数字PCR高精确度的另一个重要因素是将泊松统计引入数字PCR的检测应用中。由于数字PCR是一种终端检测的分析方法，如果目标分子没有得到很好的离散，在一个反应室中不止存在一个靶DNA，那么得到的浓度便不可信。泊松统计是对随机分布的一种描述方法，当反应室/液滴量和其中阴性比例已知，即可通过泊松模型获得初始浓度。所以，如果反应室没有达到饱和，研究者也可以计算样品的起始分子数。Beer等的研究表明，基于液滴方法的优势在于其可扩大性，增加反应容器的数量，数据的质量也就随之增大。即当扩大或增加了反应容器的数量时，泊松精度也随之提升。

同时，数字PCR能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加，反应受到