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PCR实验操作程序

1.在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：

反应物加样序体积（口1）终浓度

去离子水129.4

10XBufferB25IX

4XdNTP混合物35各200umol/L

MgCL431.5mmol/L

有义引物52.60.25ymol/L

反义引物62.60.25umol/L

模板720.1ug

TaqDNA聚合酶80.4lunit

2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50ul矿物油。每加一管换一次Tip。

3.振荡每只管，然后短暂离心。

4.将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：

预变性94℃4分钟1次

变性94-C1分钟

退火37-65c1分钟

延伸72,C1分钟

循环30次

终延伸72℃7分钟1次

保存4c

5.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80VJ5-20分钟。

6.紫外分析仪检查电泳结果。

四、讨论

1.假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻

找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻

底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA

模板配合检查模板质量。

酶失活：需更换新葡，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散

的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称

扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看0D值，更要注重引物原液琼脂糖

凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条

带，此时PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物

时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失

效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2♦浓度：随2.离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影

响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR犷增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或lOOul,应用多大体积进行

PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在小体积如20ul后，再大体积时，一定要模索条

件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温

度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增

效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR

失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板

失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的

PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除

酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③

必要时，在加标本前，反应管和剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，

这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假

阳性