草莓炭疽病菌早期检测技术规程.docxVIP

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T/JAASSXX—2022

草莓炭疽病菌早期检测技术规程

1范围

本文件规定了草莓炭疽病菌早期检测鉴定方法。

本文件适用于草莓植株及其栽培土壤中炭疽病菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

样品sample

取自某一整体的一个或多个部分，旨在提供该整体的相关信息，通常作为判断该整体的基础。

3.2

聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCR

体外酶促合成特异DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。

3.3

目标DNA阴性对照negativeDNAtargetcontrol

不含外源目标核酸序列的DNA片段，该对照用于证明测试样品中不含有目标序列。

3.4

目标DNA阳性对照positiveDNAtargetcontrol

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从可溯源的标准物质提取的DNA或从含有目标序列的阳性样品中提取的DNA，用于证明测试样品中的分析结果含有目标序列。

3.5

空白对照blankcontrol

以无菌水替代DNA样品，用于证明检测试剂中不含有目标序列。

4实验室总体要求及工作人员操作要求

草莓炭疽病菌检测实验室应划分相对独立的工作区，进入各工作区域应严格按照单一方向进行，工作人员在整个实验操作过程中要戴手套，各个工作区的功能、仪器配置以及工作人员操作要求见GB/T6682、GB/T27403和SN/T1193。

5仪器设备与试剂

5.1仪器设备

PCR仪、凝胶成像系统、台式离心机、纯水仪、电泳仪、漩涡振荡器、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌锅、电子天平、冰箱（4℃、-20℃)、制冰机、接种器械灭菌器、多样品组织研磨仪。

培养皿、镊子、手术剪、手术刀、移液器、带滤芯吸头（10μL、200μL和1000μL）、滤纸、离心管（100μL、1.5mL、10mL和50mL）、钢珠、封口膜。

5.2主要试剂

葡萄糖、琼脂、氨苄青霉素、链霉素、次氯酸钠、70%乙醇、DNA聚合酶、引物、无毒核酸染料、裂解缓冲液、真菌DNA提取试剂盒。

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备参见附录A。

本标准所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的规定。

6草莓炭疽病基本信息

中文名：草莓炭疽病

英文名：Strawberryanthracnosedisease

病原菌分类地位：半知菌亚门、类腔菌纲、黑盘孢目、黑盘孢科、刺盘孢菌属（Colletotrichumspp.）。其他信息参见附录B和C。

7样品采集

对春季草莓育苗母株按1%的比例随机抽样，对夏、秋季草莓匍匐茎苗按1‰的比例随机抽样，分别检测每棵草莓的叶片、叶柄、根茎和匍匐茎，采样前观察待检植株有无炭疽病典型症状，并进行拍照及记录。土壤样品通常取植株周围耕作层5g-10g土样。

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取样工具提前采用121±2℃（1.1×105Pa）高压灭菌的方式进行消毒处理。取样过程中佩戴一次性手套，每取1个样品后，用75%乙醇对取样工具进行擦拭消毒，每份样品单独置于一次性自封袋中并编号。

8样品贮运

采集的样品立即放置于添加冰块或冰袋的保温箱中，尽快送至实验室，保存于4℃冰箱中备用。

9样品制备

从待检样本中直接提取DNA，也可从48h预培养获取的菌丝体中提取DNA，前者需时短、成本较高，后者需时较长、成本低。

9.1从待检样本中直接提取DNA

9.1.1DNA提取

植物组织或土壤样品的DNA采用商业试剂盒进行提取，提取步骤详见使用说明，每个样品提取3个平行样。

9.1.2DNA质量检查

将提取的DNA取3μL进行琼脂糖凝胶电泳，DNA样品电泳后呈现出一条明显而清晰的条带，可用于进行分子生物学鉴定，也可用分