动物组织切片的制作与染色-PPT.pptxVIP

1水产动物组织切片的制作与染色

2一、实验目的学习石蜡切片法了解组织染色原理掌握各组织器官的基本结构

3组织切片标本—载玻片——盖玻片组织——二、实验原理

4二、实验原理取材固定脱水透明浸蜡包埋切片染色封片

51.取材根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。①种类：②部位：肝③年龄或发育阶段④是观察横切面还是纵切面？取材原则：动作------快，轻，用力均匀体积合适：0.3×0.3×0.3cm刀要锋利及时固定:编号,注明采集时间、地点、名称、组织部位

62.固定取材后应及时固定，编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位。目的---保持原来的结构固定液：波恩氏液固定时间：48h左右固定后的处理：将固定液换成70%乙醇作短期保存

7单一固定液复合固定液—长处突出，短处抵消（Bouin’s）

8固定组织时应注意：①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。③组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。④冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。⑤抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。

9水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮。它既能与水相混合，又能与透明剂相混。脱水的过程：70%→80%→90%（各1h）→95%→95%→100%→100%（各20min）脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但不能过度脱水（过久使组织变脆,收缩）3.脱水

104.透明二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。替代品：水杨酸甲酯（30min），氯仿等。

11将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，便于今后的包理与切片（1h）。浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱（60℃）中进行，以利石蜡浸入组织内。5.浸蜡

12将液态石蜡缓缓倒入金属模具中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入金属模具，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（约15min）。6.包埋

137.切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，附于小木块上通常切片厚度为5～6um切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。

14贴片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落。在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥。

158.染色（H.E）碱性染料，使细胞核等呈紫蓝色——嗜碱性酸性染料，使一般胞质和胶原纤维呈粉红色——嗜酸性苏木精（hematoxylin）伊红（eosin）

16染色液配制

179.封片染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。

18三、实验主要仪器切片机烤片机摊片机

19四、实验试剂Bouin氏液：饱和苦味酸75ml,甲醛25ml，冰乙酸5ml。Ehrilich氏酸性苏木素液：苏木素2g，纯酒精100ml，钾明矾15g，蒸馏水100ml，甘油100ml，冰醋酸10ml1%伊红染液：中性曙红0.5~1g，蒸馏水100ml1%盐酸-酒精分化液：浓盐酸1ml，70%酒精99ml。梯度酒精：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。二甲苯石蜡中性树胶

20五、实验步骤（1）取材

21取材固定（24-36h）→70%乙醇（1h）→80%乙醇（1h）→90%乙醇（1h）→95%乙醇（20min*2）→100%乙醇（20min*2）水杨酸甲酯（约30min）→1/2石蜡+1/2二甲苯（20min）→蜡杯（20min*2）→包埋→切片→贴片→烤片（2）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片

22（3）H.E.染色流程二甲苯脱蜡（1）（10min）→二甲苯脱蜡(2)（5min）→1/2100%乙醇+1/2二甲苯（1）（3min）→100%乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→80%乙醇（2min）→70%乙醇（2min）→蒸馏水洗（3min）吸水→苏木精染色（14min）→自来水洗（10min）→分化液分化（3s）→自来水洗（3～