DB50T 1763-2024四种致兔腹泻病原菌检测 多重PCR法.docx

ICS65.020.30

CCSB41

DB50

重庆市地方标准

DB50/T1763—2024

四种致兔腹泻病原菌检测多重PCR法

2024-12-17发布2025-03-17实施

重庆市市场监督管理局发布

I

DB50/T1763—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由重庆市畜牧科学院提出。

本文件由重庆市农业农村委员会归口并组织实施。本文件起草单位：重庆市畜牧科学院。

本文件主要起草人：杨柳、许国洋、牟豪、余远迪、戴玉娇、付利芝、李星、王永康、白运川。

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DB50/T1763—2024

四种致兔腹泻病原菌检测多重PCR法

1范围

本文件规定了四种致兔腹泻病原菌检测多重PCR法的检测原理、仪器设备、试剂耗材、试剂配制、方法步骤、结果描述及判定和生物安全要求。

本文件适用于兔粪便或肠容物中铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和肠致病性大肠埃希菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，所注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

多重聚合酶链式反应(多重PCR)Multiplepolymerasechainreaction

多重聚合酶链式反应指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增，结合一定的检测手段对扩增产物进行检测，从而实现对多个靶标进行诊断的技术。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

TAE：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐（Tris（hydroxymethyl）aminomethaneacetatesalt）eta：外毒素A（ExotoxinA）

nuc：耐热核酸酶(Thermostablenuclease）

eae：大肠埃希菌紧密素（E.coliattachingandeffacing）

5检测原理

用多重PCR法，对四种致兔腹泻病原菌的特异基因进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

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6仪器设备

包括以下仪器设备：

a）PCR仪；

b）全自动凝胶成像仪；

c）电泳仪器；

d）超净工作台；

e）A2生物安全柜；

f）高速冷冻离心机；

g）电子天平：感量0.01g。

7试剂耗材

包括以下试剂耗材：

a）商品化的2×TaqPCRMasterMix；b）商品化的2×TaqPCRMasterMix；

c）琼脂糖；

d）商品化的DNA回收试剂盒；e）商品化的50×TAE缓冲液；

f）阳性质控菌株：铜绿假单胞菌CVCC3796、产气荚膜梭菌CVCC1128、金黄色葡萄球菌CVCC1882、肠致病性大肠埃希菌CVCC1450；

g）阴性质控：水；

h）引物：见表1。

注：除特别说明外，所有试剂为分析纯或生化试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。

表1致兔腹泻的铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和肠致病性大肠埃希菌检测引物

病原菌名称

目标基因

引物序列

产物大小（bp）

铜绿假单胞菌

eta基因

上游引物：5＇-AGTTGGTCGCTGAACTGGC-3

下游引物：5＇-TGCATCTCGTTGCTCTCGTG-3

200

产气荚膜梭菌

α毒素基因

上游引物：5＇-AGAGAACATGCATGAGCTTCAA-3

下游引物：5＇-TGCGCTATCAACGGCAGTAA-3

313

金黄色葡萄球菌

nuc基因

上游引物：5＇-TGGCATATGTATGGCAATTGTTTCA-3

下游引物：5＇-GCTTGTGCTTCACTTTTTCTTAAA-3

609

肠致病性大肠埃希氏菌

eae基因

上游引物：5＇-CTCCGATTCCTCTGGTGACG-3

下游引物：5＇-TGGCCTTGCCAGGAGTATTG-3

1053

8试剂配制

8.11×TAE缓冲液（1L）

取50×