实验碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt

实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定

一、目的要求学习分光光度法测定的原理和方法010102学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。02分光光度法的基本原理及方法二、原理利用吸收光谱对物质进行定性分析原理2．主要方法：（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸2.酪氨酸3.色氨酸比较吸光度的比值纯DNA利用吸收光谱对物质进行定量分析原理1Beer-Lambert（比尔）定律：2T=I/I03A=lg1/T=lgI0/I4A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；5K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度6标准曲线法01OD或Ａ02浓度03标准曲线与样品的测定条件必须一致。04常用方法1标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。2摩尔吸光系数法C=A/?（?为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。酶促反应v-[S]曲线01其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数04v02推导出米氏方程为：03(三)米氏常数的测定原理米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/[S]作图，可得一条直线1/v1/Vm-1/Km1/[S]本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。器材：恒温水浴锅、722分光光度计试剂：0.5?mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠—碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.1mol/LNaOH、6mg/mL碱性磷酸酶酶液010201试剂与器材四、分光光度计的使用1．722型分光光度计的外形“波长设置”旋钮：用于设置分析波长“0%T”键：用于自动调整零透射比“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式仪器操作键介绍样品测试操作3.样品测试操作①打开电源开关，使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路④盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零⑤取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比⑥按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)⑦将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中⑧打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖⑨将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A⑩将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。返回返回返回五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(?mol)00.05