《戴安HPLC基础知识》课件.pptVIP

**********************液相色谱仪(HPLC)基础知识探讨液相色谱仪(HPLC)的原理和应用,为您全面介绍这种强大的分析工具。从样品预处理到检测分析,详细剖析HPLC的运作过程。HPLC的基本原理色谱分离机制HPLC通过样品在固定相和流动相之间的不同分配实现对样品成分的分离。固定相和流动相的化学性质决定了样品组分的保留时间。流体传输HPLC利用高压泵将流动相推送至色谱柱中,样品通过进样装置注入流动相,经过色谱柱分离后进入检测器。色谱图分析HPLC检测器会记录样品组分在色谱柱中的保留时间和浓度,生成色谱图用于定性和定量分析。HPLC的主要组成部分高压液体洜负责将流动相以恒定的流速输送到色谱柱中。进样器用于将样品精准地注入到液相色谱系统中。色谱柱是进行分离的核心部件,柱填料的性质决定了色谱分离模式。检测器检测流出色谱柱的成分浓度,并将信号转换为数字信号。HPLC样品进样系统1手动进样需要人工操作,可重复性较差2自动进样通过自动进样器控制,大幅提高重复性3微量进样仅需几微升样品,适合微量样品分析4大量进样可进样上百微升,增加灵敏度HPLC样品进样系统主要包括手动进样和自动进样两种方式。自动进样可以大幅提高重复性和效率,并且可以根据分析需求选择微量或大量进样。不同进样系统会影响分析结果的准确性和灵敏度。HPLC色谱柱及其选择柱类型选择根据分离目标和样品特性,可选用反相柱、正相柱、离子交换柱等不同类型。填充粒子尺寸一般使用3-5微米的小粒子填充柱,可提高分离效率和灵敏度。柱长度和直径柱长度决定分离分辨率,柱直径决定体积流速和柱压。根据需求选择合适尺寸。柱相互作用机理了解柱相和样品间的相互作用,有助于选择合适的色谱条件。HPLC流动相及其配制选择合适溶剂选择色谱分离所需的最佳溶剂组合,如水、甲醇、乙腈等,根据分析物的物理化学性质进行优化。配制流动相准确称量所选溶剂的体积或质量,通过混合搅拌得到所需的流动相组成。过滤脱气将配制好的流动相通过滤膜过滤,并通过抽滤或超声波脱气,去除可能导致干扰的气泡。pH调节根据分析物的性质,适当调节流动相pH,以优化色谱分离效果。HPLC溶剂梯度渐变溶剂在HPLC分析中,使用渐变溶剂可以更好地分离复杂样品中的成分。通过改变流动相的组成比例,可以调节分子在固定相与流动相之间的分配系数,从而达到最佳分离效果。梯度程序HPLC梯度程序通常从低极性溶剂开始,随时间逐渐增加高极性溶剂的比例。这样可以先洗脱出低极性组分,然后逐步洗脱出高极性组分。优化策略优化HPLC梯度程序需要结合样品的性质、分离目标和仪器条件进行多次尝试。这需要一定的经验积累和实践操作。HPLC检测器的类型1紫外-可见检测器利用分析物在特定波长的吸收特性进行检测,适用于许多有机化合物的分析。2荧光检测器可测定分析物在特定激发波长下发出的荧光辐射,对于一些具有荧光特性的化合物非常敏感。3电化学检测器通过测量分析物在特定电位下的氧化还原电流进行检测,适用于一些电活性物质的分析。4质谱检测器利用分析物的特定质荷比进行检测,可提供结构信息,在化合物鉴定中应用广泛。紫外-可见检测器紫外-可见检测器是HPLC中最常用的检测器之一,它能够检测样品在200-800nm波长范围内的吸收光谱。不同化合物有不同的吸收特性,可用于定性和定量分析。该检测器耐用,灵敏度高,适用于大多数HPLC应用。用户可以根据实际需求选择固定波长或扫描波长模式。检测器的灵敏度和选择性可以通过调整波长来优化。此外,还可以利用二极管阵列检测器获得更丰富的光谱信息。荧光检测器荧光检测器利用被测物质受到激发光照后释放出的荧光进行检测。与吸收检测相比,荧光检测具有更高的灵敏度和选择性,适用于痕量分析。常用于分析蛋白质、核酸等生物大分子。检测灵敏度可达10e-9~10e-12g/mL。电化学检测器电化学检测器是HPLC常用的一种检测器,它能检测能被氧化或还原的化合物。工作原理是利用化合物在电极表面发生的氧化还原反应产生的电流信号来检测和定量分析目标化合物。电化学检测器包括电位检测器、电流检测器和伏安检测器等。它们具有灵敏度高、选择性好、噪音小等优点。质谱检测器高灵敏度检测质谱检测器具有毫微克级的超高灵敏度,能检测微量样品中微小的化合物。检测多种化合物质谱可以同时检测并分析样品中的多种化合物,为复杂样品分析提供强大支持。精准化合物鉴定质谱图谱能提供化合物的精确分子量信息,为物质鉴定提供关键依据。HPLC分离模式1正相色谱分离使用极性固定相,非极性移动相,适用于分离极性较小的