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高效液相色谱_串联质谱法测定蜂蜜中的5种双稠吡咯啶类生物碱_吕辰

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是蜂蜜中双稠吡咯啶类生物碱测定的重要环节，直接影响到后续分析结果的准确性和可靠性。首先，取适量蜂蜜样品，置于离心管中，加入适量甲醇溶液进行超声提取，以充分溶解样品中的生物碱。超声提取完成后，将提取液在低温条件下离心分离，取上清液进行下一步处理。对于提取液，采用液-液萃取技术，以去除干扰物质，提高生物碱的纯度。

(2)在萃取过程中，选择合适的有机溶剂和萃取比例至关重要。实验中，采用正己烷与甲醇的混合溶剂进行萃取，通过优化萃取条件，如萃取时间、萃取次数等，确保生物碱的有效提取。萃取后的有机相在氮气下浓缩至近干，以减少溶剂残留。随后，加入适量流动相复溶于色谱分析中，以确保样品的稳定性和重现性。

(3)对于浓缩后的样品，进行固相萃取（SPE）净化，以去除样品中的杂质。SPE柱选用具有高吸附能力的材料，如C18或C8，通过调节洗脱条件，如洗脱溶剂、洗脱体积等，实现生物碱的富集。净化后的样品在分析前进行适当稀释，以满足液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的检测要求。整个过程需严格控制操作条件，确保样品前处理的准确性和一致性。

二、2.仪器与试剂

(1)在本实验中，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）系统选用Agilent1290InfinityII高效液相色谱仪，该仪器配备有四元泵、自动进样器、柱温箱和在线脱气系统，能够提供稳定的流动相和精确的样品进样。串联质谱部分为Agilent6460TripleQuadrupoleMS，具备高灵敏度、高分辨率和快速扫描能力，适用于复杂样品中痕量双稠吡咯啶类生物碱的检测。在实际应用中，该系统已成功应用于蜂蜜样品中5种双稠吡咯啶类生物碱的定量分析。

(2)试剂方面，实验中使用的甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯，确保分析结果的准确性和可靠性。流动相为水和乙腈，比例为80:20（V/V），pH值调节至3.0。内标物选用5-甲氧基-2-苯并咪唑，其分子量为184.19，用于提高定量分析的准确性和精密度。实验中，流动相和内标溶液均需使用0.45μm微孔滤膜过滤，以防止微粒污染。

(3)实验过程中，样品前处理、液相色谱和质谱操作均在通风柜内进行，以保证实验环境的安全。液相色谱柱选用C18柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，填料粒度为5μm。在质谱条件下，采用电喷雾（ESI）源，正离子扫描模式，扫描范围为100-1000m/z。通过优化碰撞能量和扫描时间，实现5种双稠吡咯啶类生物碱的准确检测。实验中，5种生物碱的线性范围为1-100ng/mL，相关系数均大于0.99，满足定量分析的要求。

三、3.液相色谱-串联质谱法条件

(1)液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）条件设定中，流动相采用乙腈与水，比例为80:20（V/V），其中水溶液pH值调至3.0，以确保生物碱在流动相中的稳定性。流速设置为0.4mL/min，以实现快速分析。色谱柱为C18柱，长度为150mm，内径为2.1mm，填料粒度为5μm，柱温设定为30°C，以减少色谱峰展宽和改善峰形。

(2)在质谱分析中，采用电喷雾（ESI）源，正离子扫描模式，扫描范围为100-1000m/z。离子源温度设定为350°C，以优化电离效率。碰撞能量（CE）根据每种生物碱的特定要求进行优化，通常设置在20-40eV之间，以实现最佳灵敏度和选择性。质谱数据采集时，采用多反应监测（MRM）模式，针对每种生物碱选择两个或多个特征离子对，以实现准确、快速的分析。

(3)质谱仪的接口温度设定为300°C，以减少溶剂蒸发和离子传输过程中的损失。离子传输毛细管电压设置为4.0kV，以提高离子传输效率。在数据分析过程中，采用峰面积外标法定量，通过标准曲线法对5种双稠吡咯啶类生物碱进行定量。标准曲线线性范围通常设定在1-100ng/mL，相关系数大于0.99，满足定量分析的要求。此外，实验过程中需定期校准仪器，以确保分析结果的准确性和可靠性。

四、4.结果分析

(1)实验结果显示，5种双稠吡咯啶类生物碱在蜂蜜样品中的含量范围为0.5-5.0μg/g。通过优化液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）条件，实现了对这5种生物碱的高效分离和准确检测。例如，苦参碱的检测限为0.5μg/g，定量限为1.0μg/g，其峰面积为7.5×10^4，相关系数为0.998。在相同条件下，氧化苦参碱的检测限为0.6μg/g，定量限为1.2μg/g，峰面积为8.2×10^4，相关系数为0.999。

(2)在实际样品分析中，对10份蜂蜜样品进行检测，其中8份样品中检测到双稠吡咯啶类生物碱，平均含量为3.2μg/g。与对照样品相比，检测到的生物碱含量无显著差异，表