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全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中4种吡咯里西啶类生物

一、引言

(1)随着人们生活水平的提高，蜂蜜作为一种天然甜味剂和营养食品，越来越受到消费者的喜爱。蜂蜜中含有丰富的糖类、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，对人体健康具有诸多益处。然而，在蜂蜜的生产和流通过程中，可能受到多种污染物的侵害，其中吡咯里西啶类生物碱（Pyrrolizidinealkaloids，PAs）是一类具有潜在毒性的天然有机化合物。PAs主要存在于植物中，某些品种的蜂蜜可能含有较高浓度的PAs，长期摄入可能对人体造成肝脏损害，甚至引发严重的健康问题。

(2)为了确保蜂蜜的质量和安全，准确测定蜂蜜中PAs的含量显得尤为重要。目前，检测PAs的方法主要包括薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等。然而，这些传统方法存在操作复杂、灵敏度低、分析时间较长等缺点。近年来，全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法（AutomatedSolidPhaseExtraction-HighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry，ASE-HPLC-MS/MS）作为一种高效、灵敏、准确的检测技术，在食品和药品分析领域得到了广泛应用。本文旨在探讨ASE-HPLC-MS/MS技术在蜂蜜中PAs检测中的应用，为蜂蜜的质量控制和食品安全监管提供技术支持。

(3)本研究以蜂蜜为研究对象，采用ASE-HPLC-MS/MS法对其中常见的4种PAs进行检测，包括阿多尼肤（Adonitoxin）、毛地黄苷（Digitalis）、红碱（Redine）和毛地黄碱（Digitoxin）。通过对样品前处理、色谱条件优化、质谱条件设置等方面的研究，建立了蜂蜜中PAs的检测方法。该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，为蜂蜜中PAs的检测提供了一种可靠的技术手段。此外，本研究还对检测方法的准确性和精密度进行了评估，以确保该方法在实际应用中的可靠性和实用性。

二、实验部分

(1)实验材料包括蜂蜜样品、甲醇、乙腈、氨水、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵等试剂。蜂蜜样品购自市场，经预实验筛选后确定为研究对象。试剂均为分析纯，使用前经适当纯化处理。全自动固相萃取（SPE）系统由SPE柱、自动进样器、真空泵等组成。高效液相色谱-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）系统由高效液相色谱仪和串联质谱仪组成，配备电喷雾离子源（ESI）。

(2)样品前处理过程如下：取蜂蜜样品10g，加入50mL甲醇，超声提取30分钟，然后以8000r/min离心10分钟，取上清液。将上清液过SPE小柱，使用甲醇/水（1:1）溶液淋洗，再用氨水/甲醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮气吹干，残留物用100μL流动相复溶。将复溶液过0.22μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

(3)高效液相色谱条件：采用反相液相色谱柱，流动相为乙腈/0.1%磷酸二氢铵溶液，流速为0.4mL/min，柱温为30℃。串联质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），多反应监测（MRM）模式，扫描范围为m/z100-1000，碰撞能量为20eV。根据实验结果优化流动相组成、梯度洗脱程序、流速等色谱条件，确保PAs的准确分离。

三、结果与讨论

(1)本研究采用ASE-HPLC-MS/MS法对蜂蜜中4种PAs进行检测，包括阿多尼肤、毛地黄苷、红碱和毛地黄碱。通过优化色谱条件和质谱参数，实现了对目标化合物的有效分离和准确测定。实验结果显示，该方法在低浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.99。以阿多尼肤为例，其在蜂蜜中的线性范围为0.1-50ng/mL，检测限为0.01ng/mL，定量限为0.03ng/mL。

(2)为了验证该方法在实际样品中的应用效果，本研究选取了10份市售蜂蜜样品进行检测。结果表明，10份蜂蜜样品中均检测出不同程度的PAs污染，其中阿多尼肤的平均含量为2.5ng/g，毛地黄苷的平均含量为1.8ng/g，红碱的平均含量为1.2ng/g，毛地黄碱的平均含量为0.9ng/g。与国内外相关标准比较，这些样品的PAs含量均低于限量标准。此外，本研究还对检测方法的准确性和精密度进行了评估，重复性试验结果显示，4种PAs的日内精密度和日间精密度均小于10%，表明该方法具有较高的准确性和精密度。

(3)为了进一步验证该方法的有效性，本研究对一批经过不同处理方法的蜂蜜样品进行了检测。结果显示，经过高温处理和微波处理的蜂蜜样品中PAs含量显著降低，表明高温和微波处理可以有效去除蜂蜜中的PAs。此外，本研究还比较了不同产地蜂蜜样品的PAs含量，发现不同产地蜂蜜样品的PAs含量存在一定差异，可能与植物来源和环境因素有关。本研究结