WDR63在特发性肺纤维化中的调控作用研究.pdfVIP

摘要

特发性肺纤维化（idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF）是一种未明原因的慢性、进

行性间质性肺病（interstitiallungdisease,ILD）。作为最常见的ILD之一，IPF大约占据

ILD病例的25%。IPF的患病率与年龄、性别有着明显的相关性，随着年龄的增长其患

病率逐渐上升。IPF在50岁以下人群中很少见，但是常见于65岁以上人群。据统计，

70%的IPF患者为男性，男性患病率显著高于女性。IPF从确诊之日起中位生存期为3-

5年，进行性呼吸困难和呼吸衰竭是其最常见的自然病史。尽管抗纤维化药物尼达尼布

和吡非尼酮已经被批准使用，目前仍然没有除肺移植以外的治疗IPF的手段与方法。

由于缺乏常规治疗手段，探究IPF的具体发病机制、了解IPF疾病中病理激活的分子

途径，对未来开发新型靶向疗法意义重大。

WDR63属于WDR家族，WDR又称WD40重复结构域（WD40Repeat

Domain）,WDR家族蛋白不仅与疾病相关的基因网络有关，而且是许多癌症、代谢紊

乱、神经系统疾病和再生医学治疗的候选蛋白，同家族的WDR5已被证明有助于

TGF-β的Smad相关和非Smad相关（ERK1/2）信号通路的激活，诱导EMT，促进上

皮细胞形成肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associatedfibroblasts，CAFs），因此我们推

测，WDR63同样也参与了肺纤维化的相关机制。然而截止目前，WDR63与IPF的关

系尚未有人报道。

本研究首先通过组学分析的方法，分析了GEO数据库中多组IPF患者数据集，发

现了WDR63基因在IPF患者的肺组织中高表达；免疫组织化学法检测到WDR63在博

来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型的肺泡上皮细胞高表达；qRT-PCR与WB实验检测到

WDR63在多种药物（TGF-β、HO、博来霉素）处理的细胞损伤模型中高表达。因

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此，我们猜想WDR63与肺纤维化存在着密不可分的关系。

为了验证WDR63影响肺纤维化的具体分子途径，我们构建了WDR63基因过表达

质粒，并且通过慢病毒包装与侵染的方法，构建了稳定转染过表达WDR63的A549-

WDR63细胞系，qRT-PCR与WB实验验证了A549-WDR63细胞系的过表达效率。接

着，我们针对A549-WDR63细胞系进行了CCK8、细胞划痕、Transwell等实验，探索

WDR63基因对细胞活力、细胞迁移的影响，随后通过β-半乳糖苷酶染色实验与细胞凋

亡检测试剂盒检测了WDR63对细胞衰老与细胞凋亡的影响。结果表明，过表达

WDR63能够抑制A549细胞的迁移能力与细胞活力，促进A549细胞衰老与凋亡。

为了探明WDR63基因诱导细胞衰老的分子信号途径，我们通过qRT-PCR与WB

实验检测了A549-WDR63细胞中衰老相关信号通路p53、p21基因的表达情况。结果

显示，p53、p21表达水平在A549-WDR63细胞中显著升高，证明了WDR63基因能够

通过激活p53/p21信号通路，诱导细胞衰老。后续的免疫共沉淀实验也证明了WDR63

能够与P53相互作用，促进P53入核，激活p53/p21信号通路，诱导细胞衰老。

细胞衰老能够诱导细胞产生衰老相关分泌表型(SenescenceAssociatedSecretory

Phenotype,SASP)，促进上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）与

成纤维细胞的活化与增殖，诱导成纤维化细胞向肌成纤维细胞转变。为了验证过表达

WDR63能否通过诱导细胞衰老促进肺纤维化的进展，我们检测了A549-WDR63细胞

中促纤维化信号通路TGF-β与PI3K信号通路中相关基因的表达。结果发现，对比对

照组，A549-WDR63细胞中TGF-β1、p-Smad3、p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β的表达水

平显著上升，证明了TGF-β、PI3K信号通路的激活。另外，WB实验检测到A549-

WDR63细胞中EMT途径相关基因E-钙粘蛋白的表达水平下降与波形蛋白的表达水平

上升，证明WDR63同样促进了EMT途径，诱导肺纤维化。

综