Amh在大口黑鲈卵巢中的功能及其信号通路的研究.pdf

摘要

抗缪勒氏管激素（Anti-Müllerianhormone，AMH）是TGF-β家族成员之一，由卵

巢颗粒细胞合成分泌，参与哺乳动物原始卵泡募集以及优势卵泡选择，并在卵母细胞成

熟过程中发挥重要作用。先前在硬骨鱼类中的研究，多将Amh作为一种雄性标记基因，

在雄性个体性别分化过程中发挥重要作用，其在鱼类卵巢发育中同样发挥重要作用，但

作用机制还不明确。本文以重要经济养殖鱼类大口黑鲈（Micropterussalmoides）为研究

对象，对大口黑鲈Amh及受体基因进行鉴定分析，研究Amh在大口黑鲈卵巢中的表

达模式及功能，探索Amh对受体基因及下游Smads信号通路的调控作用，初步了解

Amh在大口黑鲈卵巢中的功能及下游相关信号通路，研究结果如下：

1.本研究对Amh及受体基因进行分离和鉴定分析，扩增得到大口黑鲈Amh基因

ORF区长为1632bp，共编码543个氨基酸，其氨基酸序列1-21位为信号肽，21-22位

氨基酸之间为信号肽剪切位点，含有AMH-N端结构域，同时末端含有TGF-β保守结构

域。

大口黑鲈AMH氨基酸序列与小口黑鲈同源性较高，系统发育树结果显示，大口

黑鲈Amh序列与鳜鱼等聚为一支，与大口黑鲈的分类学地位相一致。而大口黑鲈

Bmpr2序列与舌齿鲈等鱼类的AmhrⅡ序列聚为一支，Bmpr2b序列与金头鲷等鱼类的

Bmpr2序列聚为一支。同时双荧光素酶报告基因实验结果表明，Amh可以显著激活

Bmpr2的表达，提示大口黑鲈Bmpr2可能为Amh下游受体基因。

2.通过半定量PCR检测Amh、Bmpr2在大口黑鲈中的组织分布，结果显示，大

口黑鲈Amh主要表达于精巢和卵巢，其他组织表达量较少，Bmpr2仅表达于精巢和卵

巢。收集不同发育时期的大口黑鲈卵巢样本，对其进行组织学观察，发现收集到Ⅱ期、

Ⅲ期、Ⅳ期以及Ⅴ期卵巢，其中Ⅳ期卵巢又具体区分为Ⅳ期早、中、晚期。荧光定量PCR

技术检测Amh在大口黑鲈卵巢发育不同时期的表达，发现在不同时期均有表达，其中

在Ⅲ期表达量显著高于其他时期。通过免疫荧光技术检测AMH在大口黑鲈卵巢中的定

位，结果显示AMH主要表达于滤泡层细胞。

3.利用大口黑鲈AMH融合蛋白对大口黑鲈卵母细胞进行体外孵育实验，结果显

示，与对照组相比，不同浓度AMH处理均可以显著促进卵母细胞生发泡破裂，提高

GVBD率，随后利用WesternBlot检测AMH处理后，CyclinB信号通路表达变化，

结果显示AMH处理可以显著提高CyclinB的总蛋白水平，而CyclinB的磷酸化水平

显著降低，说明AMH可以激活CyclinB信号通路。研究结果表明AMH在卵巢中发

挥重要作用，可能参与调控大口黑鲈卵母细胞成熟。

4.为研究Amh对大口黑鲈卵巢类固醇激素合成酶表达的影响，利用大口黑鲈

AMH融合蛋白对卵母细胞进行体外孵育实验，检测了类固醇激素生成相关基因

StAR、17β-hsd、3β-hsd、Cyp17a2、Cyp19a1a的表达变化。结果显示：AMH处

理可以显著提高StAR、17β-hsd、Cyp17a2、Cyp19a1a的表达水平，对于3β-hsd的

表达并没有显著影响。说明AMH可以调控StAR、17β-hsd、Cyp17a2、Cyp19a1a的

表达。

使用AMHI型受体抑制剂Compou