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幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建及其产物的制备方法[发明专利

一、1.构建幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌

(1)为了构建幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌，首先通过分子生物学技术从幽门螺杆菌基因组中克隆出vacA-D基因。该基因序列经过生物信息学分析，确定其编码产物为VacA-D蛋白，该蛋白在幽门螺杆菌的致病过程中发挥重要作用。通过PCR扩增得到目的基因片段，并连接到表达载体pET系统中，构建重组表达质粒。该质粒经过酶切验证和测序分析，确保了目的基因的正确克隆和序列的准确性。

(2)将构建好的重组表达质粒通过电转化方法导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，成功构建了幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌。通过优化表达条件，如温度、诱导剂浓度和时间等，实现了目的蛋白的高效表达。在最佳表达条件下，工程菌中VacA-D蛋白的表达量可达菌体总蛋白的30%以上。通过Westernblot检测，证实了表达的蛋白与预期蛋白大小一致，并通过序列比对确认了蛋白的氨基酸序列与幽门螺杆菌原核表达产物完全一致。

(3)为进一步验证构建的工程菌的表达产物，进行了体外活性测试。将表达的VacA-D蛋白与幽门螺杆菌的宿主细胞进行共培养，发现VacA-D蛋白能够显著抑制宿主细胞的生长，抑制率达到60%。此外，通过基因敲除实验，进一步证实了VacA-D蛋白在幽门螺杆菌致病过程中的关键作用。这些数据为幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建提供了有力支持，也为后续的疫苗研发和抗感染药物开发奠定了基础。

二、2.表达产物的制备方法

(1)表达产物的制备首先通过诱导表达获得。在优化后的表达条件下，对工程菌进行IPTG诱导，诱导时间为4小时。通过SDS分析，观察到目的蛋白在菌体中大量表达，分子量约为70kDa，与预期大小一致。通过离心收集菌体，并进行超声破碎，释放出目标蛋白。

(2)超声破碎后的蛋白溶液通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。在层析过程中，目的蛋白被特异性吸附在柱上，而杂蛋白则通过柱。通过改变洗脱缓冲液的离子强度，成功洗脱出目标蛋白。纯化后的蛋白经过SDS分析，目的蛋白的纯度达到95%以上。

(3)为了进一步去除可能存在的宿主菌蛋白和其他杂质，纯化后的蛋白溶液经过透析去除盐分，并通过凝胶过滤层析去除分子量相近的蛋白质。最终获得的高纯度VacA-D蛋白，通过ELISA检测，其活性与原菌表达的VacA-D蛋白相当，表明该制备方法能够有效保留蛋白的生物活性。

三、3.产物的纯化与鉴定

(1)在构建幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌并成功获得表达产物后，对产物的纯化与鉴定成为后续研究的关键步骤。纯化过程首先采用亲和层析技术，利用目的蛋白与Ni-NTA树脂之间的特异性结合，有效地从复杂的菌体抽提物中分离出目标蛋白。实验中，通过优化层析柱的流速和洗脱条件，实现了对目的蛋白的高效捕获和洗脱。经过亲和层析纯化后，通过SDS电泳分析，目的蛋白的纯度显著提高，从初步的30%提升至90%以上。

(2)为了进一步去除可能存在的杂质蛋白，对亲和层析后的蛋白溶液进行了凝胶过滤层析。该步骤旨在通过分子量大小差异，将目的蛋白与分子量相近的蛋白质分离。实验中，采用Sephacryl200HR凝胶柱，在0.1MTris-HCl缓冲液中，通过流速和压力的控制，实现了对目的蛋白的纯化。经过凝胶过滤层析，目的蛋白的纯度进一步提升，达到98%以上。同时，通过比较不同分子量蛋白质的洗脱峰，验证了凝胶过滤层析的有效性。

(3)在纯化完成后，对VacA-D蛋白进行了全面的鉴定。首先，通过Westernblotting技术，使用特异性抗体对目的蛋白进行检测，结果显示目的蛋白与抗体结合良好，证实了其特异性。随后，通过ELISA检测，对蛋白的活性进行了评估，结果显示纯化后的VacA-D蛋白活性与原菌表达的蛋白相当，表明纯化过程并未破坏蛋白的生物活性。此外，通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对纯化蛋白进行了序列分析，确认了蛋白的氨基酸序列与预期一致。这些鉴定结果为VacA-D蛋白的后续研究提供了可靠的基础。