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关键词：细胞状态，细胞凋亡，细胞坏死，凋亡检测指标

细胞状态检测专题|原理科普

一、细胞不同的状态

细胞死亡是生命现象不可逆停止及生命的结束，正常的组织中经常发生细胞死亡，是维持组织机能和形态所必须的，包括细胞主动死亡-程序性死亡即细胞凋亡和细胞被动死亡即细胞坏死。

主要的细胞状态：

活细胞：保持膜完整性；

衰老细胞：保持周期停滞；

细胞毒性：对细胞产生杀伤；

凋亡细胞：基本生物学现象，程序性死亡；

坏死细胞：丧失膜完整性并释放内容物。

细胞状态检测指标：

早期凋亡检测指标：AnnexinV、JC-1

中期凋亡检测指标：Caspase

晚期凋亡检测指标：TUNEL

二、不同细胞状态检测原理

细胞凋亡（apoptosis）是一种基本生物学现象，指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。

早期凋亡

在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧，而在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V(AnnexinV)是一种分子量为35~36KDa的钙离子依赖型磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。通过荧光素或者生物素标记AnnexinV即可简单快速地直接检测出细胞早期凋亡情况。

线粒体是真核细胞产生能量的场所，具有双层膜结构，包括线粒体外膜以及折叠的内膜。在完整线粒体内膜上有一个电压梯度（膜电位=△Ψm），外正内负。线粒体跨膜电位破坏是细胞凋亡发生后最早发生的细胞内变化之一。JC-1是一种碳青胺染料，在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（Ex/Em=585/590）；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（Ex/Em=510/527nm）。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化，为鉴别正常细胞和凋亡细胞提供了一种简便的方法。

中期凋亡

Caspase-1（ICE，白介素-1β-转换酶）是哺乳动物的caspase，负责将两种炎性细胞因子白介素1β和IL-18的蛋白水解成活性细胞因子，从而引发促炎反应。它还将加德敏D裂解为活性形式，从而导致细胞凋亡。Caspase-1活性分析试剂盒（比色法）基于Caspase1水解肽底物Ac-YVAD-pNA（乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp对硝基苯胺），产生黄色的对硝基苯胺（pNA），pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase1的活性。

晚期凋亡

细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧尿苷三磷酸核苷酸（dUTP）和荧光素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒（橙色荧光）提供实验所需的全套试剂组分以及优化的实验方案，适用于荧光酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪。适用于如下样品类型：贴壁细胞，悬浮细胞，石蜡包埋组织切片，冰冻切片。荧光信号检测通道为红色通道（Ex/Em=555nm/565nm）。

碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的，对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核染上。因此将AnnexinV与PI匹配使用，即可区分凋亡早、晚期细胞以及死细胞。PI在488nm，532nm或546nm激发光激发下，可发出红色荧光。

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早期凋亡检测指标：

AnnexinV-AbFluor?细胞凋亡检测试剂盒（蓝色/绿色/橙色/红色）

线粒体膜电位分析试剂盒（JC-1法）

中期凋亡检测指标：

Caspase系列活性分析试剂盒(比色法)

晚期凋亡检测指标：

TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(绿色/红色荧光)

蛋白质水平的AnnexinV系列细胞早期凋亡试剂盒，检测磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。具有更强的荧光强度和光稳定性。可通