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一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法[发明专利]

一、背景技术

(1)DHA（docosahexaenoicacid，二十二碳六烯酸）是一种重要的长链多不饱和脂肪酸，对人体健康具有诸多益处，如降低心血管疾病风险、促进大脑发育、增强视力等。在自然界中，DHA主要存在于深海鱼类和藻类中，而裂殖壶菌（Schizochytrium）是一种能够生物合成DHA的微生物，其生物转化效率较高。随着人们对于DHA需求的不断增长，开发高产DHA的裂殖壶菌突变菌株成为研究热点。

(2)现有的裂殖壶菌突变菌株筛选方法主要依赖于传统的突变诱导和筛选技术，如化学诱变、物理诱变等。这些方法存在筛选周期长、突变率低、筛选成本高等问题。据统计，传统筛选方法获得的突变菌株中，高产DHA菌株的比例仅为0.1%左右，筛选效率较低。此外，传统方法得到的突变菌株可能存在生长缓慢、适应性强等不良性状，限制了其在实际应用中的推广。

(3)近年来，随着分子生物学技术的快速发展，基因工程、代谢工程等新型育种方法在微生物育种领域得到广泛应用。通过基因敲除、基因编辑、代谢通路优化等手段，可以有效提高裂殖壶菌的DHA合成能力。例如，我国科学家通过对裂殖壶菌进行基因敲除，成功筛选出DHA含量提高30%的突变菌株；另一项研究表明，通过优化代谢通路，裂殖壶菌的DHA产量可以提高至原来的2倍。这些研究为高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选提供了新的思路和技术支持。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括裂殖壶菌野生型菌株、化学诱变剂（如甲基磺酸乙酯、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍等）、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、抗生素、营养培养基等。实验过程中，首先对野生型裂殖壶菌进行培养，以获得足够的菌株用于后续实验。培养条件为：温度28-30℃，光照周期12小时/12小时，光照强度为1000-2000勒克斯。

(2)诱变实验采用化学诱变方法，将野生型裂殖壶菌接种于含有适量化学诱变剂的液体培养基中，在上述培养条件下培养48小时。随后，通过显微镜观察细胞形态变化，筛选出具有突变特征的菌株。为了提高筛选效率，采用连续诱变和筛选的方法，即对初次筛选出的突变菌株进行二次诱变，进一步筛选出高产DHA的突变菌株。据统计，经过连续诱变和筛选，突变菌株的DHA产量可提高约50%。

(3)突变菌株的遗传稳定性分析采用PCR技术检测突变基因在子代中的表达情况。具体操作为：提取突变菌株的总DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，观察扩增产物的大小和条带情况。结果表明，突变基因在突变菌株的子代中稳定表达，表明突变基因已成功整合到裂殖壶菌的基因组中。此外，为了验证突变菌株的DHA产量，将突变菌株与野生型菌株进行对比实验。结果显示，突变菌株的DHA产量比野生型菌株提高了约60%，且突变菌株在相同培养条件下生长速度与野生型菌株相当。

三、突变菌株的筛选

(1)突变菌株的筛选首先通过化学诱变剂如甲基磺酸乙酯（MSME）对野生型裂殖壶菌进行诱变处理。经过诱变处理后，将处理过的菌株在含有丰富营养的培养基中进行培养。经过一段时间，通过显微镜观察，筛选出形态发生变化的菌株。例如，经过一次诱变后，共获得500个突变菌株，其中50个表现出明显的形态变异。

(2)在筛选出的突变菌株中，采用DHA含量测定方法对其DHA产量进行初步评估。采用高效液相色谱法（HPLC）测定DHA含量，结果显示，从50个突变菌株中，有10个菌株的DHA含量高于野生型菌株的1.5倍。进一步对这些菌株进行培养，观察其生长速度和稳定性，筛选出5个生长稳定、DHA产量高的突变菌株。

(3)为了验证这些突变菌株的遗传稳定性，对筛选出的5个突变菌株进行二次诱变，并再次进行DHA产量测定。结果显示，二次诱变后的突变菌株DHA产量均有所提高，其中一株突变菌株的DHA产量达到了野生型菌株的2.5倍。通过进一步的遗传分析，证实这些突变性状是由基因突变引起的，而非表型变异。

四、突变菌株的鉴定与验证

(1)对筛选出的高产DHA裂殖壶菌突变菌株进行鉴定，首先通过PCR技术检测突变基因的存在。利用特异性引物对突变菌株和野生型菌株的DNA进行扩增，结果显示突变菌株中存在预期的突变基因片段，而野生型菌株中则无此片段。这一结果表明突变基因已成功整合到裂殖壶菌的基因组中。

(2)为了进一步验证突变菌株的DHA合成能力，采用高效液相色谱法（HPLC）对突变菌株和野生型菌株的DHA含量进行测定。实验结果显示，突变菌株的DHA含量显著高于野生型菌株，最高可达野生型菌株的2.5倍。这一结果与初步筛选时观察到的DHA产量提高现象一致。

(3)为了确保突变菌株的遗传稳定性，对突变菌株进行连续多代培养，并定期检测其DHA产量