细胞培养的基本技术(黄建华).ppt

迟缓期（或延迟期）当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目迅速增长。期细胞倍增时间（TD）等于细胞周期时间（TC）长度。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。平衡期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代,进行一次分离再培养称之为传一代。01原代培养的首次传代是建系的关键时期，细胞需覆盖大部分瓶底后再传代。02首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。033.1原代细胞培养的传代01贴壁生长的细胞用消化法传代；02部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；03悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，3.2细胞传代方法吸除瓶内旧培养液；加入1ml消化液；37C或室温25C消化2~5分钟01显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后；02直接加少许含血清的培养液，终止消化；03细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新的培养瓶内。043.2.1贴壁细胞传代步骤直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉1/2~1/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。离心法：离心800~1000rpm，5min，除上清，加新的培养液，然后传代接种。部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代0201033.2.2悬浮细胞的传代是通过换液、传代和细胞冻存实现的：建立档案：记录组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。123.3细胞系的维持防细胞之间的交叉污染，传代时所用器械要编号或做好标记01每一种细胞系都应有充足的冻存储备，以防绝种；02另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变033.3细胞系的维持4.3.4培养细胞的纯化自然纯化自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，而排除其它细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其它细胞，达到细胞纯化的目的。4.3.4.2人工纯化利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其它细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。3.4.2.1酶消化法酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。3.4.2.2机械划除法机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现，混杂生长常常分区呈片，采用机械的方法去除不需要的细胞区域，而保留需要的细胞。3.4.2.3反复贴壁法成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10~30min完成附着过程（但不一定完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞3.4.2.4克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，然后对每一克隆进行测试，选择出所需要的克隆。3.4.2.5培养基限定方法某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则将无法生长。而其它细胞与之相反，可以利用这种技术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的HAT培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制其它细胞。冻存细胞要缓慢冷冻。01减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。02冷冻保护剂的使用，可使细胞免受冰晶形成和渗透压改变而致的损伤。常用二甲基亚砜和甘油。03冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测细胞原特性是否改变。044.1细胞的冻存取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心01细胞记数2.5x106/ml冻存液加含10%DMSO冻存液熔封置4度数小时，负20度过夜或-70°C放置2-3h移入液氮罐中记录0602030405细胞冻存步骤1取出安瓶立即放入37°C水中2消毒安瓶开封后将细胞移入离心管中加培养液离心3记数4接种培养瓶培养细胞复苏步骤冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存充液法：（1）选择生长状态良好的细胞。一般以生长1/3~1/2瓶底壁为宜，换新液，保留微量空气，拧紧瓶盖（2）用棉花等做防震防压处理4.3培养细胞的运输5细胞培养污染的检测和排除01培养细胞的污染概念包括所有混入培养环境中对细胞生存生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及