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牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因

在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）

本实验表达的His-FimA融合蛋白主要

用于后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，

因此需求量较大，而且不用考虑靶蛋白是否

具有活性。本实验所表达的His-FimA融合

蛋白主要位于包涵体中，这种以包涵体形式

表达的蛋白很稳定，不易被降解。这样在下

一步实验纯化FimA蛋白时，可以在变性条

件下溶解包涵体，以便于使用Co2+柱亲和层

析得到纯化的靶蛋白。

本实验所使用的大肠杆菌

BL21(DE3)pLysS所带pLysS具有氯霉素抗性。

在将重组质粒和空质粒转化入宿主菌时，不

需要使用IPTG进行蓝白筛选，因为pET-15b

Vector含有氨苄青霉素抗性基因，转化了

重组质粒和空质粒的BL21(DE3)pLysS同时

具有氯霉素和氨苄青霉素抗性，而未转化的

菌珠只有氯霉素抗性，这样就可以使用氨苄

青霉素来对转化菌进行筛选。

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本实验用本课题组前期构建的fimA基

因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆

菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基

因得到正确表达。

4实验二FimA蛋白的纯化与鉴定

实验材料与仪器

菌珠

携带有pET-15bVector和

pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：

实验一获得。

主要试剂

1）BCA法蛋白定量试剂盒：碧云天公司

2）TALON纯化试剂盒：Clontech

Laboratories,Inc,USA

3）其他：同实验一

实验仪器

1）宝特ELX-800酶标仪：宝特仪器有

限公司

2）其他：同实验一

实验方法样品制备

按照TALON纯化试剂盒操作说明书制备

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样品，步骤

1）在转化了质粒pET-15b-fimA的LB

固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，

接种于5mlAmp+(100μg/ml)的LB培养液

中，37℃振摇过夜。

2）将5ml过夜菌转接于500mlLB(Amp+)

培养液中，37℃振摇4h；加入IPTG致终浓

度为2mmol/L，37℃振摇3h。

3）4℃，5500r/min离心20min收集

细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃

保存。

4）用BufferA重悬细胞沉淀物，每25

ml细胞培养物使用2ml缓冲液。

5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为

止。

6）4℃，10000～12000r/min离心20min

以去除不溶性杂质。

7）小心的转移上清液到一