电子显微镜制样技术.pptx

●超薄切片

●冷冻蚀刻的复形膜

●悬浮样品的滴片

●培养细胞等

按样品类别：

按研究内容：

·对细胞膜上的抗原或抗体进行免疫标记

●追踪细胞中某些大分子的放射自显影标记

●对细胞中的某些生化成分作定位、定性、定量研究

●细胞膜、细胞器的超微结构进行观察

样品要很薄(纳米);良好保存精细结构；

样品具一定反差。

对于TEM观察的生物样品的特殊要求：

生物常规样品透射电镜制备技术

——超薄切片技术

超薄切片技术的基本操作程序

取材→预固定→后固定→脱水→浸透→包埋→修块→切片一→染色

漂洗

漂洗

包埋聚合

取材

后固定

浸透

漂洗

梯度脱水

前固定

块染

电镜观察

取材——按“快、小、轻、准、冷”的原

则，在切断血供1-2分钟之内将放入固定液。

超薄切片的基本操作程序

用物理或化学的方法迅速杀死细

胞，使组织细胞的形态结构尽可能地保存在接近其生活时的状态。

固定

2.5-4%戊二醛冰箱保存或送电镜室，2小时后改刀为≤1mm³的样品。

主要对糖原、核酸、尤其是对微管、内质网和细胞基质有较好的固定作用。

前固定

漂洗——0.1M磷酸缓冲液

10~15分钟，3次。

1%锇酸。

主要对脂类、蛋白质进行固定。

后固定：

漂洗：0.1M磷酸缓冲液

10~15分钟，3次。

漂洗与脱水

用能与水和包埋剂相混合的

有机溶剂(乙醇和丙酮),除去组织中的游离水，使包埋剂能均匀渗透入组织块内。

脱水：

乙醇或丙酮梯度脱水：50%、

70%、80%、90%各10-15分钟/次，100%10-15分钟/2次。

浸透与包埋

组织块在脱水后，需用一种常温下为液态，经过加温聚合后具有一定硬度的介质对其进行处理，使处理后的组织有适当的硬度和良好的切割性能。

包埋剂：DDSA、MNA、Epon812、DMP30

丙酮：包埋剂=1:1;

丙酮：包埋剂=1:3;纯包埋剂浸透1-3小时。

浸透：

A3C

图2.1—3各种包埋模具

A.多孔锥形橡胶包埋板B.药用胶囊C.定向橡胶包埋板

包埋：

用包埋剂将样品包埋在胶囊或包埋板里。

常用包埋模具

置烤箱：37℃,12小时；

45℃,12~24小时；60℃,24小时；

超薄切片

经标本修块、半薄定位后，

用制备的玻璃刀通过钻石刀通过超薄切片机将样品切成厚约

50nm~70nm的超薄切片，将切片捞于载网上。

标本修块

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

LKB制刀机

图2.1—8LKB7800制刀机

1.托架2.夹头3.玻璃划割器4.导板5.断裂旋钮6.盖板压条

7.底座8.调节盘9.托板10.盖板

Peichert

Reichert:JungKNIFEMAKER

(1)(2)(3)(4)(5)

图2-5优质刀和劣质刀模式图(正面观)

1.优质刀2.刀缘有裂痕3.刀缘过凸4.刀缘过凹5.双刀跟(未成刀)

玻璃刀的质量

刀根

玻璃刀与钻石刀

图2.1—9玻璃刀

A.用胶布制作的刀槽：B.用金属片或工程塑料制作的刀槽

超薄切片机

图2.1-11切片过程示意图

A组织块通过刀刃时的情况；B组织块下沿平行刀口，切出连续切片；C组织块下沿不与刀口平行，切片散开。

超薄切片

图2.1-4铜网的类型

1.150目2.150目3.150目4.180目5.180目6.180目

7.75/200目8.单孔1.29.单椭圆孔10.双狭缝11.三狭缝12.多狭缝

载网类型

23456

O

9

10

7

8

1

铜网：TEM样小又薄，常用φ3mm铜网(200目方孔或圆孔)来支持、承载样品。

200目圆孔载铜网200目方孔载铜网

超薄切片机

UItramicrotome

超薄切片

Uitrathinsectioringwith

glassordiamondknives

架合包埋

Embeddinginepoxyresin(egEpon)andpolymerizat