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毕业设计（论文）

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基于CRISPRCas9构建小鼠UOX基因敲除模型

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基于CRISPRCas9构建小鼠UOX基因敲除模型

摘要：本研究旨在利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠UOX基因敲除模型，以研究UOX基因在肝脏氧化还原平衡及代谢性疾病中的作用。通过设计靶向UOX基因的sgRNA，构建敲除UOX基因的CRISPR/Cas9载体，并转染小鼠胚胎干细胞。经过基因编辑和细胞筛选，成功获得UOX基因敲除小鼠。通过组织学观察、蛋白质和基因表达分析等方法，验证了UOX基因敲除小鼠的构建成功。进一步研究显示，UOX基因敲除小鼠的肝脏氧化还原平衡紊乱，且对氧化应激的耐受性降低。本研究为研究UOX基因在肝脏疾病中的作用提供了新的动物模型，并为肝脏代谢性疾病的治疗提供了新的思路。

肝脏是人体内最大的代谢器官，承担着物质代谢、解毒、储存等重要功能。肝脏氧化还原平衡的维持对肝脏的正常生理功能至关重要。UOX（UDP-glucuronosyltransferase1A1）是肝脏中的一种关键酶，参与胆汁酸代谢和药物代谢等过程。近年来，研究发现UOX基因突变与多种肝脏疾病的发生发展密切相关。因此，研究UOX基因在肝脏中的作用对于理解肝脏疾病的发病机制及治疗具有重要的意义。CRISPR/Cas9技术作为一种高效的基因编辑技术，为构建基因敲除模型提供了新的手段。本研究旨在利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠UOX基因敲除模型，为研究UOX基因在肝脏中的作用提供实验基础。

一、1.CRISPR/Cas9技术原理及sgRNA设计

1.1CRISPR/Cas9技术原理

CRISPR/Cas9技术是一种基于细菌天然免疫系统的基因编辑技术，具有高效、简单、经济的特点。该技术的基本原理是利用Cas9蛋白与一段特定的RNA序列（sgRNA）结合，形成Cas9-RNA复合体，然后识别并结合到目标DNA序列上。Cas9蛋白具有一个核酸酶活性位点，可以在识别位点附近切割双链DNA，产生双链断裂（DSB）。随后，细胞内的DNA修复机制（如非同源末端连接NHEJ或同源重组HR）会修复这一断裂，从而实现对目标基因的精确编辑。

在CRISPR/Cas9技术中，sgRNA的设计至关重要。sgRNA由两部分组成：一部分是靶标序列，另一部分是结合Cas9蛋白的茎环结构。靶标序列通常为20-25个碱基，需要与目标DNA序列精确匹配。sgRNA的设计需要遵循一定的原则，如避免与基因组其他区域的高度同源性，以确保编辑的特异性。研究表明，CRISPR/Cas9技术在人类基因组上的编辑效率可达99%以上，而在小鼠等模式生物中的编辑效率更是高达90%以上。

CRISPR/Cas9技术在基因编辑领域取得了显著的成果。例如，在癌症研究方面，CRISPR/Cas9技术被用于研究肿瘤抑制基因的功能，发现敲除这些基因可以抑制肿瘤的生长。在遗传病研究方面，CRISPR/Cas9技术被用于构建遗传病模型，为疾病的治疗提供了新的思路。此外，CRISPR/Cas9技术在农业领域也显示出巨大的潜力，通过编辑农作物基因，可以提高产量、抗病性和营养价值。据统计，CRISPR/Cas9技术自2012年首次被报道以来，全球已有超过2000项研究涉及该技术，其应用范围不断扩大。

1.2sgRNA设计原则

(1)sgRNA设计是CRISPR/Cas9技术成功的关键步骤之一。一个有效的sgRNA设计需要考虑多个因素，包括靶标序列的选择、PAM序列的识别、sgRNA的二级结构以及脱靶效应的评估。靶标序列的选择应避免与基因组其他区域的高度同源性，以减少脱靶效应的风险。根据一项研究，sgRNA靶标序列的脱靶率在人类基因组中约为1/10000，而在小鼠基因组中约为1/1000。在实际应用中，选择靶标序列时，应优先考虑那些与疾病相关或具有生物学意义的基因。

(2)PAM序列是Cas9蛋白识别并结合到靶标DNA的关键结构。PAM序列通常为5-NGG-3，其中N代表任意碱基。PAM序列的存在是sgRNA设计的前提条件，没有PAM序列，Cas9蛋白无法结合到DNA上。因此，在sgRNA设计时，必须确保PAM序列的正确性和位置。研究表明，PAM序列的存在可以提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率，例如，在人类细胞中，含有PAM序列的sgRNA的编辑效率比不含PAM序列的sgRNA高10倍。此外，PAM序列的突变或缺失会导致Cas9蛋白无法结合，从而降低编辑效率。

(3)sgRNA的二级结构对其功能至关重要。一个稳定的二级结构有助于Cas9蛋白与sgRNA的稳定结合，从而提高编辑效