检测技术方法 (2).ppt

标本的收集和保存

一般为血清标本，此外亦有唾液、尿液等其它体液；避免严重溶血，否则可能会增加非特异显色；避免细菌污染，否则会因菌体中内源性HRP而产生假阳性反应；避免反复冻融；血清如有混浊或沉淀，离心或过滤后检上清第70页,共97页，星期六，2024年，5月试剂准备从冰箱中取出的试剂，待温度与室温平衡后使用；所用蒸馏水或去离子水应保证质量。第71页,共97页，星期六，2024年，5月加样避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。第72页,共97页，星期六，2024年，5月温育

常采用的温育温度有43℃、37℃、室温和4℃等。温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与温室平衡。第73页,共97页，星期六，2024年，5月洗板每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。第74页,共97页，星期六，2024年，5月显色加入底物A和B后，应振荡混匀当底物为OPD时，显色反应应避光进行第75页,共97页，星期六，2024年，5月比色

加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定，所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色具最大光吸收）如450nm和非敏感波长（所测得的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。第76页,共97页，星期六，2024年，5月结果判断按照试剂盒确定的Cut-off值判断结果ELISA测定的“灰区”（可疑结果的含义）第77页,共97页，星期六，2024年，5月定性？定量？定性测定常以“有”或“无”也即“阳性”或“阴性”来表达测定结果；半定量测定虽介于定性和定量之间，但从严格意义上来说，其仍属于定性测定，只不过其对定性测定中的“阳性”作了进一步的分级，即所谓的强阳性·阳性·弱阳性的区别；定量测定的结果则以浓度（如IU/L、ug/L等〕的方式表达。第78页,共97页，星期六，2024年，5月定性测定结果确定的依据定性测定结果确定的依据在于阳性?阴性判定值（Cut-off）的建立，Cut-off值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现。除了Cut-off值以外，还有许多其它的设值方法以判断阴性和阳性结果，如S/N（常称为P/N）比值（Ratio）等。第79页,共97页，星期六，2024年，5月概念阳性测定能力指数（DI（＋））可定义为一实验对阳性标本测定后给出阳性结果的能力（通常称为“敏感性”）；DI（＋）=[真阳性/（真阳性+假阴性）]×100%阴性测定能力指数（DI（－））则为对阴性样本测定给出阴性结果的能力（通常称为“特异性”）；DI（－）=[真阴性/（真阴性+假阳性）]×100%第80页,共97页，星期六，2024年，5月概念阳性结果的可靠性（‘预示值’）即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。=[真阳性/（真阳性+假阳性）]×100%阴性结果的可靠性则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。=[真阴性/（真阴性+假阴性）]×100%第81页,共97页，星期六，2024年，5月测定结果的报告和数据处理酶免疫测定数据处理报告在理想情况下应达到下述要求:(1)易于让不熟悉该试验的人所理解;(2)定性测定必须结果明确,即阳性或阴性、反应或不反应、在正常范围内或不正常等；（3）定量测定的线性；（4）数据的可重复性；第82页,共97页，星期六，2024年，5月定义特异性Specificity真阴性结果数真阴性结果数+假阳性结果数第83页,共97页，星期六，2024年，5月定义敏感性Sensitivity真阳性结果数真阳性结果数+假阴性结果数第84页,共97页，星期六，2024年，5月结合物结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。第38页,共97页，星期六，2024年，5月酶用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳

定，来源丰富，