临床基因扩增检验的质量保证.ppt

Levey-Jennings质控图

基本的统计学含义稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以±3s为失控限，假失控的概率为0.3%。01质控结果02日期03试剂04质控物批号和含量05测定者姓名等。质控图的记录带滤塞吸头的使用及质检用实验来检验带滤塞吸头的质量：先纯化制备数份强阳性和数份阴性核酸标本，然后将加样器吸取量设至扩增加样所需的体积，使用待评价带滤塞吸头对一份强阳性样本来回吸取10次（模拟10份阳性样本的吸取），将最后一次的吸取液加至一含扩增反应液的管中，之后，换一个新吸头，连续吸取10份阴性样本分别至10个扩增反应管中，此过程重复3～5次，最后对每一管按所用试剂方法进行扩增检测。强阳性样本应为强阳性，阳性弱或出现阴性则说明吸头可能含有扩增抑制物。所有阴性样本应为阴性，出现阳性则表明吸头不能有效地防止气溶胶对加样器的污染。离心管PCR抑制物质检其他02核酸提取用离心管质检01扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1℃时，其可测出来。具体做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中，然后按程序进行一个常规的PCR扩增，加热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。试剂盒的质检定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差；理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP)临床基因扩增检验的操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，这其中所涉及的又主要是加样器的使用，尽管操作简单，但由于均为微量操作，要获得稳定可靠的测定结果，操作人员需要一定的专业技术知识和经验.知其然又知其所以然。12人员培训核酸样本的制备、扩增检测01及其质量控制02一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理03核酸的分离纯化04靶核酸提取的质量05临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质06核酸样本制备及扩增检测的质控07产物检测的质控08一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理1靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。2核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。01经典方法02硅吸附法03对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。04核酸的分离纯化临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质01临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。02对临床标本中可能存在的1抑制/干扰物的质控措施2质控措施：采用内质控（internalcontrol,IC）（通常称为内标）的方法3内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。4STEP2STEP1已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。