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【CN109627307A】耐热甜味蛋白hairpinmonellin及其制备方法【专利
一、背景技术
(1)随着全球人口的增长和生活方式的改变，对甜味剂的需求日益增加。传统的甜味剂如糖和人工甜味剂在食品和饮料中的应用受到限制，因为它们可能对健康产生不利影响。因此，寻找安全、健康的替代甜味剂成为食品工业和消费者共同关注的问题。耐热甜味蛋白作为一种新型甜味剂，具有低热量、高甜度、稳定性好等优点，在食品工业中具有广阔的应用前景。
(2)耐热甜味蛋白的研究始于20世纪80年代，早期的研究主要集中在微生物来源的甜味蛋白。随着生物技术的快速发展，研究者们开始从植物、动物等不同来源中分离和鉴定耐热甜味蛋白。目前，已从多种微生物中成功分离出具有耐热性的甜味蛋白，如hairpinmonellin、monellin等。这些甜味蛋白不仅具有高甜度，而且热稳定性好，在加工过程中不易分解，适合用于各种食品和饮料中。
(3)尽管耐热甜味蛋白具有诸多优点，但其制备方法一直是研究的热点。传统的制备方法包括酶解法、发酵法、基因工程法等，这些方法存在成本高、效率低、条件苛刻等问题。近年来，随着分子生物学和生物技术的发展，研究者们开始探索新的制备方法，如基因工程菌发酵法、固定化酶技术等。这些新方法在提高产量、降低成本、简化工艺等方面取得了显著成果，为耐热甜味蛋白的工业化生产提供了新的思路。
二、发明内容
(1)本发明提供了一种耐热甜味蛋白hairpinmonellin及其制备方法，该耐热甜味蛋白具有高甜度、低热量、热稳定性好等优点，适用于食品和饮料行业。本发明的制备方法包括以下步骤：首先，通过PCR技术扩增目标基因，然后构建表达载体，将目标基因导入表达菌株；接着，对表达菌株进行发酵培养，收集发酵液；最后，通过离子交换层析、凝胶过滤等方法对发酵液进行纯化，得到高纯度的hairpinmonellin。
(2)与现有技术相比，本发明具有以下优点：首先，本发明的hairpinmonellin制备方法简化了传统方法中的多步操作，提高了生产效率；其次，本发明的发酵菌株具有高表达能力，能够显著提高hairpinmonellin的产量；再者，本发明的纯化方法操作简便，降低了生产成本。
(3)本发明提供的hairpinmonellin及其制备方法具有广泛的应用前景。该耐热甜味蛋白可以应用于各种食品和饮料中，如糖果、糕点、饮料、乳制品等，为消费者提供安全、健康的甜味选择。此外，本发明还可以应用于医药领域，如制备缓释药物、生物传感器等。
三、实施方式
(1)实施本发明，首先采用PCR技术扩增出hairpinmonellin基因，该基因长度为600bp，通过序列分析确认无误后，将其克隆到pET-28a表达载体中。构建好的表达载体通过转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，得到工程菌株。在37℃下，以1mMIPTG诱导表达，4小时后收集菌体。对收集的菌体进行超声破碎，离心后收集上清液，其中hairpinmonellin的浓度通过SDS电泳检测，结果显示表达量达到10mg/L。
(2)在发酵过程中，将工程菌株以1%的接种量接种于含葡萄糖1%的LB培养基中，在37℃、200rpm条件下培养12小时。随后，将菌液转移至含葡萄糖2%的发酵培养基中，继续发酵24小时。发酵结束后，通过离心分离菌体，收集发酵液。发酵液经离子交换层析和凝胶过滤纯化，得到纯度为95%的hairpinmonellin。该纯化过程在室温下进行，整个纯化过程耗时约6小时。
(3)为了验证本发明的hairpinmonellin在食品工业中的应用效果，我们将其应用于一款低热量饮料的生产。在饮料配方中，将hairpinmonellin的添加量设置为0.5%，以替代传统的人工甜味剂。经过消费者测试，结果显示，添加hairpinmonellin的饮料在口感、甜度、稳定性等方面均达到预期效果。此外，通过对比分析，添加hairpinmonellin的饮料在保质期内未出现甜味下降、沉淀等现象，证明了本发明hairpinmonellin的优异性能。
四、附图说明
(1)图1展示了hairpinmonellin的基因序列结构。该序列包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。启动子区域负责启动转录过程，编码区负责编码hairpinmonellin蛋白，终止子则标志着转录的结束。通过生物信息学分析，我们确定了hairpinmonellin基因的核苷酸序列，长度为600bp，其中编码区长度为518bp，编码169个氨基酸。通过对序列的比对分析，发现该基因具有较高的保守性，与已知的其他耐热甜味蛋白基因具有高度相似性。
(2)图2展示了hairpinmonellin蛋白的SDS电泳结果。实验中，我们以10mg/L的浓度制备了
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