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海洋生物体中皮质醇的测定

1范围

本文件规定了海洋生物体中皮质醇检测的原理、试剂、仪器和设备、样品前处理、样品测定与结果、方法灵敏度、准确度和精密度。

本文件适用于鱼类、虾类、棘皮类、贝类生物体中皮质醇的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T8170

数值修约规则与极限数值的表示和判定

GB/T30891

水产品抽样规范

3方法原理

生物样品中的皮质醇，用0.2%甲酸乙腈溶液提取，固相萃取柱净化、浓缩，超高效液相色谱质谱联用仪检测，外标法定量。

4试剂

4.1乙腈：色谱纯。

4.2甲酸：色谱纯。

4.3氯化钠：分析纯。

4.4无水硫酸钠：分析纯。

4.50.1%甲酸溶液：用移液管量取1mL甲酸，用水稀释并定容至1000mL。

4.60.2%甲酸乙腈溶液：用移液管量取1mL甲酸，用乙腈（80%）稀释并定容至500mL。

4.7标准品：皮质醇（hydrocortisone，C21H30O5，CAS号50-23-7，纯度98%以上）。

4.8标准贮备溶液（10mg/L）：准确称取1.00mg皮质醇标准品，用乙腈稀释至10mg/L，避光贮存

在-18℃下。

4.9标准溶液(1mg/L)：准确吸取标准贮备溶液1mL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，避光冷

藏贮存于2~6℃下。

4.10针孔式微孔滤膜：0.22μm，有机系。（亲水性聚丙烯、玻璃纤维、亲水性PTFE、聚醚砜或其它

等效材质）

4.11除非另有说明，在分析中所使用的水均符合GB/T6682规定的一级用水。

5仪器和设备

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5.1超高效液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源、三重四级杆。

5.2固相萃取装置：固相萃取柱，CaptivateEMR（200mg，6cc）。

5.3离心机：转速：5000r/min。

5.4分析天平：感量0.0001g和感量0.01g。

5.5高速组织捣碎机。

5.6均质机。

5.7氮吹仪。

5.8涡旋混匀仪。

6测定步骤

6.1样品制备与保存

6.1.1水产品的试样抽取：按GB/T30891的规定执行。

6.1.2水产品试样制备：取样品约100g，用高速组织捣碎机充分捣碎，均质机混匀，均分成2份，一

份用于检测，另一份作为留样。

6.1.3样品于-18℃下冷冻避光存放。

6.2提取

称取样品5.00g，置于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入10mL的0.2%甲酸乙腈溶液，充分摇匀，涡旋，加入1g的氯化钠和4g的无水硫酸钠，充分涡旋混匀1min，超声10min，静置，以5000r/min4℃离心15min，取上清液4mL，放入空的聚丙烯塑料离心管中，加入1mL水，混匀，待净化。

6.3净化和浓缩

将待净化溶液全部倒入固相萃取柱，保持约每秒一滴的流速，收集全部流出液(抽干)，45℃水浴浓缩氮吹仪氮吹至液面高度恒定，用水定容至1mL，上清液经有机滤膜0.22μm过滤至进样瓶中，供超高效液相色谱质谱联用仪检测。

6.4样品测定

参照下述条件进行测定：

-BEHC18柱（2.1×50mmi.d.,1.7μm）；

—流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱顺序见表1；

—进样量：10μL；

—柱温：30℃;

—流速：0.2mL/min。

表1梯度洗脱顺序

时间（min）

0.1%甲酸水溶液（%）

乙腈（%）

初始

90

10

1.00

70

30

2.00

50

50

3.00

30

70

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4.00

10

90

5.00

90

10

6.00

90

10

—电离模式电喷雾电离，正模式。

—扫描模式：多反应监测（MRM）模式，监测离子对（m/z）参见表2。

表2质谱条件

化合物

离子模式

分子离子对m/z

驻留时间

s

锥孔电压V

碰撞能量eV

皮质醇

ESI+

363.2121363.2327

0.163

42

42

22

16

代表定量离子

6.5标准曲线的绘制

吸取标准溶液（4.9）5mL，用流动相逐级稀释，配制成浓度分别为0、5.