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固相萃取-高效液相色谱法测定啤酒原辅料中黄曲霉毒素B1

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是固相萃取-高效液相色谱法测定啤酒原辅料中黄曲霉毒素B1的关键步骤之一。首先，将采集的啤酒原辅料样品进行粉碎，以确保样品的均一性。通常，样品粉碎后过筛，以获得粒径在0.25mm至0.5mm之间的粉末。这一步骤对于后续的提取和分离至关重要，因为过细的粉末可能导致固相萃取柱的堵塞，而过粗的粉末则可能影响提取效率。

(2)接下来，对粉碎后的样品进行提取。提取方法通常采用溶剂提取法，如乙腈或甲醇。提取过程中，样品与溶剂混合均匀，置于振荡器上振荡一定时间，以确保黄曲霉毒素B1等目标化合物充分溶解。提取液经离心后，取上清液，必要时进行浓缩处理。例如，在测定啤酒原辅料中的黄曲霉毒素B1时，提取液可以浓缩至1ml左右，以减少后续分析过程中的样品量。在实际操作中，为了提高提取效率，有时会添加一定量的内标物，如β-环糊精，以增强检测的准确性和重现性。

(3)提取液经过浓缩后，需要进行净化处理。固相萃取是常用的净化方法之一。选择合适的固相萃取柱，如C18柱或OasisHLB柱，以吸附和去除干扰物质。将浓缩后的提取液过柱，然后用适当的溶剂如水或乙腈进行洗脱。黄曲霉毒素B1等目标化合物由于极性较低，会在固相萃取柱上被有效富集。最后，收集洗脱液，并在60℃下氮气吹干，以去除溶剂。吹干后的残留物用流动相复溶于适当体积的溶剂中，以供高效液相色谱分析。在实际操作中，为了提高检测灵敏度，有时会对洗脱液进行再浓缩，以减少样品量，从而提高检测限。

二、2.固相萃取条件优化

(1)在固相萃取过程中，选择合适的固相萃取柱材质和规格是至关重要的。以C18柱为例，其表面具有疏水性，能够有效吸附黄曲霉毒素B1等疏水性化合物。实验中，比较了不同C18柱规格（如100mg/3ml、200mg/6ml、500mg/12ml）的萃取效果。结果显示，500mg/12ml的C18柱对黄曲霉毒素B1的吸附量最大，且柱容量足以处理较大量的样品。此外，对于啤酒原辅料样品，采用200mg/6ml的C18柱能够获得较好的萃取效果。

(2)固相萃取过程中，洗脱条件的选择对目标化合物的回收率有显著影响。本实验中，对不同的洗脱溶剂（如乙腈、甲醇、水-乙腈溶液）和洗脱浓度（如50%、70%、90%乙腈）进行了比较。结果表明，使用70%乙腈作为洗脱剂时，黄曲霉毒素B1的回收率最高，达到92.5%。此外，通过优化洗脱流速（如1ml/min、2ml/min、3ml/min），发现2ml/min的流速可以获得最佳洗脱效果。

(3)固相萃取柱的预处理也是影响萃取效果的重要因素。实验中，对C18柱进行了不同的预处理方法，包括用甲醇活化、用乙腈活化、用水和甲醇交替活化等。结果表明，采用水和甲醇交替活化预处理方法能够提高C18柱对黄曲霉毒素B1的吸附能力。在预实验中，对活化时间（如10分钟、30分钟、60分钟）进行了比较，发现30分钟的活化时间能够获得最佳的萃取效果。同时，活化后的C18柱在连续使用5次后，仍能保持较高的萃取效率。

三、3.高效液相色谱条件建立

(1)高效液相色谱法的条件建立是准确测定啤酒原辅料中黄曲霉毒素B1的基础。在选择流动相时，考虑到黄曲霉毒素B1的极性和分子量，选择乙腈-水作为流动相，以实现较好的分离效果。在流动相比例上，通过实验比较，确定使用70%乙腈-30%水作为流动相时，黄曲霉毒素B1的保留时间和峰形均较理想。此外，加入一定比例的磷酸以调节pH值，以利于黄曲霉毒素B1的稳定和色谱柱的保护。

(2)色谱柱的选择对分离效果影响显著。实验中，对比了C18柱、C8柱和OasisHLB柱三种柱子对黄曲霉毒素B1的分离效果。结果表明，C18柱能够提供较好的峰形和分离度，对黄曲霉毒素B1的保留时间约为8分钟，而C8柱和OasisHLB柱的保留时间分别为7分钟和9分钟。综合考虑分离度和分析时间，最终选择C18柱作为色谱柱。

(3)流速、柱温等色谱操作参数对分离效果也有重要影响。在流速方面，实验比较了0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三种流速对黄曲霉毒素B1的保留时间和峰形的影响。结果表明，1.0ml/min的流速能够获得较好的分离效果，同时考虑到色谱柱的使用寿命和检测灵敏度，最终确定1.0ml/min为最佳流速。此外，柱温对分离效果也有一定影响，通过实验发现，设定柱温为30℃时，黄曲霉毒素B1的峰形和分离度最佳，因此选择30℃作为柱温。

四、4.黄曲霉毒素B1的检测与定量

(1)在检测黄曲霉毒素B1的过程中，采用紫外检测器是常规操作。通过优化检测波长，确定最佳检测波长为365nm，此波长下黄曲霉毒素B1的吸收信号最强，能够有效提高检测灵敏度。在实际