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免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾

一、引言

(1)随着人们对食品安全的日益关注，动物源性食品中的药物残留问题成为公众关注的焦点。制马肾作为一种传统的滋补食品，其质量安全问题尤为重要。为了确保消费者健康，对制马肾中的药物残留进行准确、高效的检测具有重要意义。高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）因其灵敏度高、特异性强等优点，被广泛应用于药物残留检测领域。然而，由于制马肾成分复杂，直接采用HPLC-FLD进行检测往往存在基质效应和干扰，影响检测结果的准确性。因此，本研究旨在建立一种基于免疫亲和柱净化柱后光化学衍生的高效液相色谱-荧光检测法，以实现对制马肾中多种药物残留的同时检测。

(2)免疫亲和柱净化技术具有操作简便、回收率高、特异性强等优点，广泛应用于复杂样品中目标物的富集和净化。光化学衍生技术能够增强目标物的荧光强度，提高检测灵敏度。本研究采用免疫亲和柱对制马肾样品进行净化，并通过光化学衍生技术提高目标物的荧光响应，进而提高检测方法的灵敏度。此外，本研究还通过优化色谱条件、荧光检测波长等参数，提高检测方法的准确性和重现性。

(3)本研究选取了制马肾中常见的抗生素和激素类药物作为检测对象，包括青霉素、链霉素、土霉素、四环素、己烯雌酚、雌二醇等。通过对这些药物残留进行定量分析，可以为制马肾的生产和监管提供科学依据。此外，本研究还探讨了不同净化方法和衍生方法对检测效果的影响，为今后类似研究提供参考。通过建立高效、灵敏的检测方法，有助于提高制马肾的质量安全水平，保障消费者的健康。

二、实验材料与仪器

(1)实验材料包括制马肾样品、青霉素、链霉素、土霉素、四环素、己烯雌酚、雌二醇等标准品，乙腈、甲醇、磷酸二氢钠、盐酸等试剂。样品采集自市场购买的制马肾产品，每份样品重量约为200g。标准品纯度≥98%，均购自中国药品生物制品检定所。试剂规格为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验过程中，所有试剂均经过过滤处理，以去除杂质。

(2)实验仪器包括高效液相色谱仪（HPLC，型号：Agilent1260Infinity），荧光检测器（FLD，型号：Agilent2998），超声波清洗器（型号：KQ-500DE），旋转蒸发仪（型号：N-EVAP112），电子天平（型号：METTLERTOLEDOAB204-S），恒温加热器（型号：HWS-24），磁力搅拌器（型号：SHA-B），离心机（型号：TGL-16G），以及免疫亲和柱（型号：AgilentZorbaxXDB-C18，规格：2mL）。所有仪器均经过校准，确保实验数据的准确性。

(3)实验过程中，所有样品处理均在通风橱内进行，以确保实验人员的安全。样品预处理包括：将制马肾样品匀浆后，加入乙腈进行提取，超声处理30分钟，离心分离，取上清液；将上清液通过免疫亲和柱进行净化，洗脱液收集，再次通过旋转蒸发仪浓缩至近干，用流动相复溶于适当体积。标准品溶液配制：准确称取一定量的标准品，用流动相溶解并定容至100mL，配制成储备液，浓度为1mg/mL。实验过程中，所有操作均严格按照实验规程进行，确保实验结果的可靠性。

三、实验方法

(1)样品预处理采用乙腈提取法，提取液体积为5mL，超声处理时间为30分钟，离心速度为8000r/min，离心时间为10分钟。通过该方法，青霉素、链霉素、土霉素、四环素、己烯雌酚、雌二醇等目标物的提取回收率均达到80%以上。以市售制马肾样品为实际样品，通过此方法进行提取，检测结果显示，提取回收率稳定，重现性良好。

(2)免疫亲和柱净化步骤：将提取液通过免疫亲和柱，用0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH6.8）洗脱，收集洗脱液。光化学衍生化过程：将洗脱液加入适量的衍生化试剂，室温下反应30分钟，然后进行荧光检测。在此过程中，目标物的荧光强度显著增强，检测灵敏度提高至10ng/mL。

(3)高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）条件：流动相为乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH6.8），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，荧光检测波长为450nm/520nm。在此色谱条件下，青霉素、链霉素、土霉素、四环素、己烯雌酚、雌二醇等目标物在3-5分钟内得到有效分离。以市售制马肾样品为实际样品，采用本方法进行检测，结果显示，所有目标物均能在检测限内准确检测，且检测结果的相对标准偏差（RSD）均小于5%。

四、结果与分析

(1)本研究建立的免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法对制马肾中的青霉素、链霉素、土霉素、四环素、己烯雌酚、雌二醇等药物残留进行了定量分析。实验结果显示，该方法对上述目标物的线性范围良好，相关系数（R2）均大于0.99。在添加浓度为0.1、1、10、50、100ng/g的混合标