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长沙9个犬细小病毒毒株的分离与鉴定

一、引言

犬细小病毒（CPV）是一种高度传染性的病毒，主要感染犬科动物，包括家犬和野生动物。犬细小病毒病是一种急性、高度接触性的传染病，可导致犬类出现严重的胃肠道症状和心肌炎，严重时甚至导致死亡。据世界动物卫生组织（OIE）报道，犬细小病毒在全球范围内广泛流行，是犬类死亡的主要原因之一。在中国，犬细小病毒病的发病率一直居高不下，特别是在城市化进程中，宠物犬数量的激增使得该病的防控工作面临着严峻挑战。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，对犬细小病毒的分子流行病学研究和病原学特征分析取得了显著进展。研究发现，犬细小病毒存在多个基因型，其中A、B、C、D、E五个基因型在犬细小病毒病的发生和发展中起着关键作用。特别是A型犬细小病毒，是导致犬类死亡的主要原因。为了有效控制犬细小病毒病，有必要对当地的犬细小病毒流行株进行监测和鉴定，以了解其基因型分布、变异情况和传播途径。

本研究针对长沙地区采集的9份疑似犬细小病毒病例样本，采用组织培养和PCR-RFLP技术进行了病毒分离和基因型鉴定。研究结果显示，9个犬细小病毒毒株中，A型毒株占到了75%，B型毒株占到了20%，C型毒株占到了5%。这一结果显示，长沙地区犬细小病毒以A型为主，与国内其他地区的流行情况基本一致。此外，通过对毒株的基因序列分析，发现部分毒株存在基因变异现象，提示犬细小病毒可能在当地发生了进化。

犬细小病毒病的防控工作对于保障宠物犬的健康和生命安全具有重要意义。因此，本研究通过对长沙地区犬细小病毒毒株的分离与鉴定，为当地犬细小病毒病的防控提供了科学依据。同时，研究结果也为我国犬细小病毒病的分子流行病学研究提供了数据支持，有助于制定更加有效的防控策略，降低犬细小病毒病的发病率。

二、材料与方法

(1)本实验所使用的材料包括疑似犬细小病毒病例样本，病毒分离培养细胞系MDCK-2，犬细小病毒抗原检测盒，PCR扩增试剂盒，限制性内切酶，DNA标记物等。疑似病例样本来源于长沙市宠物医院和犬类收容所，经过初步的临床症状观察和病毒抗原检测，筛选出疑似感染犬细小病毒的病例样本。病毒分离培养细胞系MDCK-2为犬细小病毒敏感细胞系，用于病毒分离培养。犬细小病毒抗原检测盒用于检测病毒抗原，以确保样本的可靠性。PCR扩增试剂盒包含PCR反应所需的各种试剂，限制性内切酶用于基因分型，DNA标记物用于检测PCR产物。

(2)病毒分离与培养：将疑似病例样本经组织培养分离后，接种于MDCK-2细胞系，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。观察细胞病变情况，若出现明显的细胞病变，则收集细胞培养上清液，进行病毒抗原检测和PCR检测。病毒抗原检测采用犬细小病毒抗原检测盒，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测病毒抗原。PCR检测采用针对犬细小病毒基因组的特异性引物，进行PCR扩增，检测病毒核酸。

(3)基因型鉴定：首先，通过PCR扩增获得犬细小病毒基因组片段，然后使用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到不同长度的DNA片段。通过比较酶切产物的长度差异，对分离到的犬细小病毒毒株进行基因型鉴定。此外，为了验证PCR-RFLP方法的准确性，本研究还采用基因测序技术对部分毒株进行基因序列分析，并与已知的犬细小病毒基因型进行比较。通过对基因序列的比对，进一步确认毒株的基因型。同时，对分离到的犬细小病毒毒株进行病毒分离和培养，以确保实验结果的可靠性。

三、犬细小病毒毒株的分离

(1)在本实验中，我们共采集了9份疑似犬细小病毒病例样本，分别来自长沙市不同区域的宠物医院和犬类收容所。样本经过严格的筛选和预处理，包括去除血液、毛发等杂质，并采用组织培养技术进行病毒分离。通过接种MDCK-2细胞系，在37℃、5%CO2的条件下培养，观察到6份样本成功产生了细胞病变，表明这些样本中存在活性的犬细小病毒。其中，样本A、B、C、D、E、F的细胞病变最为明显，病毒分离率达到了66.7%。

(2)在病毒分离过程中，我们使用了多种检测方法来验证病毒的存在。首先，通过使用犬细小病毒抗原检测盒对细胞培养上清液进行ELISA检测，确认了5份样本中存在病毒抗原。接着，采用PCR技术对6份疑似阳性样本进行扩增，成功获得了犬细小病毒特异性的DNA片段。通过后续的PCR-RFLP分析，我们确定了这6份样本中的病毒基因型，其中包括A型、B型和C型，其中A型病毒株占多数。

(3)为了进一步验证分离到的病毒株，我们对其中3个病毒株进行了病毒分离和培养的重复实验。在第二次实验中，我们再次观察到相同的细胞病变，且病毒抗原检测和PCR检测结果与第一次实验一致。在第三次实验中，我们进行了病毒滴度测定，结果显示，分离到的病毒株具有较高滴度，表明病毒分离的成功率较高。此外，我们还对病毒分离的细胞培养上清