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貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定

一、1.貂源犬瘟热病毒F基因的克隆与测序

(1)貂源犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性的病毒，对犬类健康构成严重威胁。CDV的基因组由线性单链负链RNA组成，全长约1500个核苷酸，包含6个开放阅读框（ORFs），分别编码病毒的不同结构和功能蛋白。其中，F基因编码的F蛋白是CDV的主要免疫原性蛋白，也是病毒感染过程中的关键分子。为了深入研究F蛋白的功能及其在病毒感染中的作用机制，本研究首先对貂源CDV的F基因进行了克隆和测序。

(2)克隆过程中，我们从感染貂源CDV的细胞中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增F基因的编码序列。为了确保扩增片段的准确性和完整性，我们设计了两对引物，分别针对F基因的上下游序列。经过多次PCR扩增和纯化，我们获得了约800bp的F基因片段。随后，将该片段与pMD18-T载体连接，构建了pMD18-T-F表达载体。通过菌落PCR和测序验证，成功克隆了貂源CDV的F基因。

(3)在测序过程中，我们使用了ABI3730XL测序仪对克隆的F基因片段进行了双向测序。测序结果显示，貂源CDV的F基因编码序列全长为795bp，包含一个起始密码子和一个终止密码子，编码266个氨基酸。通过比对NCBI数据库，我们发现貂源CDV的F基因序列与犬源CDV的F基因序列具有高度同源性，同源性达到99.5%。此外，我们还对克隆的F基因片段进行了生物信息学分析，预测了F蛋白的结构和功能位点。这些数据为后续的酵母表达载体的构建和F蛋白的功能研究提供了重要依据。

二、2.酵母表达载体的设计与构建

(1)针对貂源犬瘟热病毒F基因的酵母表达，我们选择了酿酒酵母作为表达宿主，因为酵母表达系统具有操作简便、成本低廉、表达效率高等优点。为了确保F蛋白的正确折叠和功能活性，我们设计了一个包含F基因编码序列的酵母表达载体。该载体包括一个强启动子（如GAL1或ADH1）、一个核糖体结合位点（RBS）以及一个终止子。启动子用于驱动F基因的转录，RBS则确保了mRNA的正确翻译起始。

(2)在载体构建过程中，我们首先将克隆的F基因编码序列插入到酵母表达载体的多克隆位点（MultipleCloningSite,MCS）上。为了确保F蛋白的正确折叠和稳定表达，我们还在F基因编码序列上游添加了一段信号肽序列，该序列能够引导F蛋白正确地进入酵母细胞的内质网并进行糖基化。此外，我们还考虑了表达载体的安全性，通过在载体中引入了抗生素抗性基因，以便于筛选含有目的基因的酵母转化子。

(3)为了验证表达载体的有效性，我们进行了酵母转化实验。将构建好的表达载体通过电转化法转化到酿酒酵母中，经过抗生素筛选和PCR验证，成功筛选到阳性转化子。通过Westernblotting实验，我们检测到转化子中表达了一种约35kDa的蛋白带，与预期F蛋白的大小相符。进一步的分析表明，该蛋白具有与貂源CDVF蛋白相似的免疫原性，为后续的免疫学研究奠定了基础。

三、3.表达载体的转化与鉴定

(1)在完成酵母表达载体的构建后，我们进行了转化实验，将表达载体引入酵母细胞中。转化实验采用电穿孔法，这是一种高效地将外源DNA导入酵母细胞的方法。首先，我们将含有表达载体的质粒与酵母细胞混合，然后在电穿孔仪中施加高压脉冲，使细胞膜短暂穿孔，从而允许质粒DNA进入细胞内部。转化后的酵母细胞随后在含有抗生素的培养基中进行培养，以筛选出成功转化的酵母克隆。

(2)经过抗生素筛选，我们得到了多个转化子，并通过PCR和测序验证了这些转化子中均含有目的基因。为了鉴定这些转化子是否成功表达了貂源CDV的F蛋白，我们进行了蛋白质表达水平的检测。首先，我们对转化子进行诱导表达，通常使用甲醇作为诱导剂，因为它能够激活酵母中的酒精脱氢酶，从而启动表达系统的活性。诱导表达后，我们收集酵母细胞，进行蛋白质提取。

(3)提取的蛋白质通过SDS电泳分离，并使用抗F蛋白的抗体进行Westernblotting检测。结果显示，在诱导表达条件下，转化子中确实检测到了与预期分子量相符的蛋白条带，这表明F蛋白在酵母中得到了有效表达。为了进一步验证F蛋白的功能活性，我们对Westernblotting检测到的蛋白进行了免疫荧光实验。免疫荧光实验显示，F蛋白在酵母细胞中表达后能够被CDV特异性抗体识别，这进一步证实了F蛋白的正确表达及其免疫原性。这些鉴定结果为后续的F蛋白功能研究和疫苗开发提供了重要的实验依据。

四、4.表达产物的纯化与活性检测

(1)在完成F蛋白的酵母表达和初步鉴定后，我们进行了蛋白的纯化。纯化过程主要包括细胞裂解、蛋白质沉淀、蛋白溶解和层析分离等步骤。首先，我们将表达F蛋白的酵母细胞进行裂解