地贫筛查中的血红蛋白电泳.ppt

地贫筛查中的血红蛋白电泳

操作技术

解放军第三0三医院血液实验室

王荣新血红蛋白的组成血红蛋白由血红素与珠蛋白组成血红素：铁原子与原卟啉Ⅸ复合物。珠蛋白：包括α、β、γ、δ、ε和ζ珠蛋白6种。血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的不同发育时期，其主要的血红蛋白（Hb）组成不同。发育期血红蛋白肽链组成胚胎期Gower1ζ2ε2Gower2α2ε2胎儿期Porlandζ2γ2Fα2γ2Aα2β20－2周岁左右Fα2γ2Aα2β2A2α2δ22周岁后以后Aα2β2A2α2δ2Fα2γ2Hb的种类A.正常的Hb分三类01HbA(α2β2)HbF(α2γ2)HA2(α2δ2)B.异常Hb有两类02快速异常Hb:稳定Hb慢速异常Hb:不稳定Hb醋酸纤维膜电泳琼脂凝胶电泳醋酸纤维膜电泳→主要过程←琼脂凝胶电泳↓RBC洗涤↓制备溶血↓点样↓电泳↓染色与脱色↙↘扫描法↙比色法:分区剪下色带，洗脱分区切割色带,融化琼脂，干燥,透明→比色血红蛋白电泳设备▋▋▉▋▋▋JKAGDE点样线→正常→▉▍▋▋?HbA2的常用测定方法原理:根据不同Hb自带电荷的不同、分子量大小的不特定方向泳动，在一定的电压下经一定时间，可分主要类别:醋酸纤维素膜电泳法琼脂凝胶电泳法同、结构和等电点的不同,在一定pH值的缓冲液中朝离出各自的区带。HbA2含量测定:洗脱法扫描法123456

血红蛋白A2测定

01不连续电泳将HbA2分离后，分别剪02出膜条中的HbA和HbA2区带，分别放入试03管中，HbA加蒸馏水20ml，HbA2加4ml04，浸泡30分钟，不定时摇动，使Hb完全05冼脱下来后混匀，用721分光光度计以波06长413nm蒸馏水校正零点，读取光密度OD07值并计算出结果。抗碱血红蛋白(HbF)测定01设备：721分光光度计，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗02，滤纸。03试剂：1/12mol/LKOH或NaOH溶液，酸性半饱和硫酸04铵溶液。05方法：取两支试管，测定管加入溶血液0.1ml，对照06管加入0.02ml，于测定管中加入KOH1.6ml，摇匀，071分钟时立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒08转6次，放10分钟，滤取溶液检测，用波长540nm09蒸馏水校正零点，分别读取测定管和对照管光密度10OD值，计算出结果。HbCS的区带多在HbA2位置的前后，含量低，2％左右，很不稳定，有时还可分开成三或四小区带，用联苯胺染色可确定。HbE为慢速异常区带，其位置相当于HbA2。HbH和HbBart’s为快速异常区带。目前国内使用的主要有美国的Helena电泳仪、扫描仪和分析系统。法国的Sebia电泳仪、扫描仪和分析系统。国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。通过扫描定量给出HbA、HbA2和HbF值。异常区带通过查表确定。HbE区带的鉴别01联苯胺染色,鉴定是否为Hb区带位于HbA2区带位置上,在阴性(-)泳动速度最慢的一种异常Hb,难与A2区分开HbA2定量在10%以上,应考虑为HbE020304HbE纯合子只有HbF和HbE,HbE高达95%以上联苯胺染色,确定是否为Hb在阳极(+)泳动速度最大的Hb区带HbH包含体阳性(+)pH6.5缓冲液(酸性)唯一向阳性(+)移动的Hb区带Hb↓MCV↓MCH↓HbBart’s区带在HbH区带后,泳动速度比HbH稍慢些,有Bart’s区带,一般都有H区带,H含量高达30%多,但不会超出40%,低少到1%左右。HbA2组成:α2δ2HbA2参考值:1.2%-3.5%HbA2含量的改变:HbA2水平升高,是β地贫基因携带者的特征性标志,故HbA2定量的准确与否,对于临床一线β地贫基因携带者的筛查至关重要。