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豹源猫杯状病毒ORF2基因的扩增、克隆及原核表达

一、1.豹源猫杯状病毒ORF2基因的扩增

(1)豹源猫杯状病毒（FelineNorovirus,FNV）是一种常见的猫肠道病毒，其感染猫科动物，可导致猫出现急性胃肠炎症状。ORF2基因是FNV基因组中的一个开放阅读框，编码的蛋白质在病毒感染过程中发挥重要作用。为了深入研究ORF2基因的功能，首先需要从病毒基因组中扩增出该基因片段。本研究中，我们设计了一对特异性的引物，基于已知的ORF2基因序列，通过PCR技术从FNV阳性样本中扩增出目标基因片段。在PCR反应中，我们优化了反应体系，包括模板DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度和反应温度等条件，以确保扩增出高质量的基因片段。

(2)为了确保扩增出的ORF2基因片段的准确性和完整性，我们对PCR产物进行了电泳检测。通过1%的琼脂糖凝胶电泳，我们可以观察到清晰的条带，其大小与预期片段大小一致。随后，我们将PCR产物进行纯化，去除未结合的引物、dNTPs和DNA聚合酶等杂质，以获得高纯度的模板DNA。纯化后的PCR产物通过测序验证了其序列的正确性，确保了后续实验的可靠性。

(3)在完成ORF2基因的扩增和序列验证后，我们将其克隆到表达载体中。首先，我们选择了一个合适的原核表达载体，该载体含有T7启动子和终止子，可以驱动目的基因在原核细胞中高效表达。通过限制性内切酶酶切载体和PCR产物，我们获得了具有粘性末端的DNA片段。随后，通过T4连接酶将目的基因片段与载体连接，构建了重组表达质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌中，通过抗生素筛选和PCR验证，成功构建了表达ORF2蛋白的原核表达菌株。这一步骤为后续的原核表达实验奠定了基础。

二、2.ORF2基因的克隆

(1)在完成ORF2基因的扩增和序列验证后，我们选择了pET-28a表达载体进行基因克隆。该载体含有T7启动子，适用于在大肠杆菌中高效表达外源蛋白。首先，我们使用BamHI和EcoRI对pET-28a表达载体进行酶切，释放出线性化的载体分子。接着，将经过PCR扩增的ORF2基因片段用相同的酶切，以确保其与载体分子具有匹配的粘性末端。通过T4DNA连接酶将两者连接，构建重组表达质粒。转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选，成功筛选出含有重组质粒的克隆。

(2)为了验证重组质粒的正确性，我们对筛选出的阳性克隆进行了PCR鉴定和酶切分析。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示目的基因片段大小与预期相符。此外，对重组质粒进行BamHI和EcoRI酶切，观察到两条带，其中一条为载体片段，另一条为目的基因片段，进一步证实了克隆成功。此外，我们还对重组质粒进行了测序，测序结果与原基因序列完全一致，确保了克隆的准确性。

(3)在完成重组质粒的构建和验证后，我们将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，该菌株具有T7启动子，有利于表达目的蛋白。转化后，通过IPTG诱导，成功实现了ORF2蛋白的表达。在SDS电泳分析中，观察到目的蛋白在约30kDa处出现特异性条带，表明ORF2蛋白在大肠杆菌中得到表达。通过不同IPTG浓度的诱导实验，我们优化了表达条件，最终在0.5mMIPTG诱导下，目的蛋白表达量达到最高。这一结果为后续的原核表达和纯化实验提供了有力支持。

三、3.ORF2基因的原核表达

(1)ORF2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达是一个关键步骤，我们通过IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导蛋白的表达。为了优化表达条件，我们首先进行了不同IPTG浓度和时间点的诱导实验。在实验中，我们设置了0.1mM、0.5mM、1mM和2mM的IPTG浓度，分别于诱导后4小时、8小时和12小时收集细胞裂解物。通过SDS电泳分析，我们发现0.5mMIPTG浓度下，目的蛋白的表达量最高，且蛋白的溶解度较好。因此，我们选择0.5mMIPTG作为后续表达的诱导浓度。

(2)在确定了IPTG的诱导浓度后，我们进一步优化了表达温度和时间。在30℃、37℃和42℃三个温度下进行了诱导实验，结果显示在37℃下目的蛋白的表达量最高。同时，我们也比较了不同诱导时间（4小时、8小时和12小时）对蛋白表达的影响，发现8小时的表达时间能够达到最佳效果。基于这些结果，我们确定了37℃和8小时作为后续实验的优化条件。

(3)经过IPTG诱导和优化条件确定后，我们进行了目的蛋白的纯化。首先，通过超声波破碎细胞，释放出内含目标蛋白的细胞裂解物。然后，使用Ni-NTA亲和层析柱对裂解物进行纯化。在纯化过程中，我们使用了一系列洗脱缓冲液，以逐步增加盐浓度，使目的蛋白从柱子上洗脱下来。通过SDS电泳和Westernblot分析，我们验证了纯化蛋白的纯度和特异性。最终，我们得到了高纯度的OR