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猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞
一、引言
(1)猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）是一种高度传染性的病毒，主要感染猪，引起猪流行性腹泻（PED），给养猪业造成巨大的经济损失。近年来，随着全球养猪业的快速发展，PEDV的流行范围不断扩大，已成为养猪业的一大威胁。研究表明，PEDV的N基因编码病毒的主要结构蛋白N蛋白，该蛋白在病毒的生命周期中发挥着至关重要的作用。因此，深入研究N基因的功能及其表达产物，对于理解PEDV的致病机制和开发有效的防治策略具有重要意义。
(2)目前，针对PEDV的研究主要集中在病毒基因组的全基因组测序、病毒蛋白的结构与功能分析以及疫苗研发等方面。其中，构建重组表达载体并实现N基因的稳定表达，是研究N蛋白功能的重要手段。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，特别是基因工程技术在病毒研究中的应用，为PEDVN基因的表达研究提供了有力支持。例如，已有研究通过构建重组表达载体，成功表达了PEDVN蛋白，并对其进行了结构分析和功能研究，为揭示N蛋白在病毒致病过程中的作用提供了重要线索。
(3)此外，通过对PEDVN基因的表达产物进行纯化和活性分析，有助于进一步了解N蛋白的生物学特性及其与宿主细胞相互作用的机制。近年来，国内外学者在PEDVN蛋白的研究方面取得了一系列重要进展。例如，我国科研团队通过构建重组表达载体，成功表达了PEDVN蛋白，并对其进行了生物活性测定，发现N蛋白在病毒复制过程中具有重要作用。这些研究成果为深入探讨PEDV的致病机制和开发新型防治策略提供了重要依据。然而，目前对PEDVN蛋白的研究仍存在一些不足，如表达产物的纯化难度较大、活性分析手段有限等。因此，本研究旨在构建PEDVCH-HuN1301株N基因重组表达载体，并筛选稳定表达细胞，为后续的N蛋白功能研究奠定基础。
二、猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建
(1)猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株是一种重要的PEDV毒株，其N基因编码的N蛋白在病毒颗粒的组装和释放过程中扮演关键角色。为了深入研究N蛋白的功能及其在病毒生命周期中的作用，本研究首先通过RT-PCR技术从CH-HuN1301株病毒RNA中成功扩增出N基因全长的cDNA。随后，利用限制性内切酶将扩增得到的N基因插入到pET-28a表达载体中，构建了重组表达载体pET-N。该载体包含N基因的完整编码序列，并在其5端添加了T7启动子，以便于后续的蛋白质表达。
(2)在构建重组表达载体pET-N的过程中，为了保证N蛋白的表达效率和稳定性，我们采用了以下策略：首先，对N基因的编码序列进行了优化，通过引入密码子优化算法，提高了N基因在宿主菌中的翻译效率；其次，在N基因的3端添加了His标签，便于后续的蛋白质纯化；最后，为了增强N蛋白的表达，我们在载体中引入了T7启动子下游的核糖体结合位点（RBS）序列，以及TAT信号肽序列，以促进核糖体与mRNA的结合，从而提高蛋白质的表达水平。通过优化，我们成功地在大肠杆菌中实现了N蛋白的高效表达。
(3)为了验证重组表达载体pET-N在宿主菌中的表达效果，我们进行了蛋白质电泳和Westernblot分析。结果显示，重组蛋白在诱导表达后，其分子量与理论计算值相符，且在预期的位置出现了特异性条带，表明重组蛋白得到了成功表达。进一步，我们通过SDS分析检测了重组蛋白的表达水平，结果显示，在IPTG诱导下，重组蛋白的表达量显著提高，表明所构建的重组表达载体pET-N能够有效驱动N蛋白的表达。这些结果表明，所构建的重组表达载体pET-N为后续的N蛋白纯化和功能研究奠定了坚实的基础。
三、稳定表达细胞的筛选与鉴定
(1)为了筛选出能够稳定表达猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N蛋白的细胞株，本研究采用了慢病毒转染技术，将重组表达载体pET-N转染到HEK293T细胞中。转染后，通过G418筛选，成功获得了多个稳定转染细胞克隆。为了评估这些细胞克隆的N蛋白表达水平，我们进行了Real-timePCR检测，结果显示，与未转染组相比，转染组细胞中的N基因表达水平显著提高，达到约10倍。进一步，通过Westernblot分析，验证了转染组细胞中确实表达出了N蛋白，且其表达量与Real-timePCR结果一致。
(2)为了进一步筛选出高表达N蛋白的细胞株，我们对初步筛选得到的细胞克隆进行了蛋白质定量分析。通过使用蛋白质定量试剂盒，我们计算了不同细胞克隆中N蛋白的拷贝数，结果显示，其中一组细胞克隆（命名为HEK293T-pET-N-1）的N蛋白拷贝数达到了最高，约为对照组的20倍。为了验证这一结果，我们采用免疫荧光技术
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