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猫杯状病毒反向遗传系统的建立及弱毒株的构建

一、猫杯状病毒反向遗传系统的建立

(1)猫杯状病毒（FCV）是一种高度传染性的病毒，主要感染家猫，可引起猫的急性肠炎和呼吸道疾病。为了深入研究FCV的致病机制和疫苗研发，建立反向遗传系统成为关键。本研究中，我们首先通过RT-PCR技术从猫肠道样本中成功提取了FCV的RNA，随后利用RACE技术对病毒基因组进行了克隆和测序。通过比对已知序列，我们确认了该病毒基因组的全序列，全长约8.1kb，包含7个开放阅读框（ORFs）。随后，我们构建了含有完整病毒基因组的重组质粒，并成功转化大肠杆菌，实现了病毒基因组的体外扩增。

(2)在获得病毒基因组的基础上，我们进一步构建了反向遗传系统。首先，我们利用同源重组技术将病毒基因组的各个ORFs克隆到表达载体中，构建了多个缺失突变株。通过细胞培养和病毒滴度测定，我们筛选出能够稳定传代并产生病毒的缺失突变株。其中，缺失病毒基因组的N基因、P基因和M基因的突变株表现出明显的减毒现象。此外，我们还通过基因替换策略，将减毒株中的相关基因替换为野生型基因，构建了重组病毒。通过病毒滴度测定和细胞致病性测试，我们验证了重组病毒的减毒效果，为后续疫苗研发奠定了基础。

(3)为了进一步验证反向遗传系统的有效性，我们选取了N基因缺失突变株进行深入研究。通过基因敲除和替换，我们构建了N基因缺失和替换的重组病毒。在细胞培养实验中，我们发现N基因缺失突变株的病毒滴度显著降低，且对细胞的致病性减弱。进一步地，我们通过动物实验，将N基因缺失突变株接种于实验小鼠，观察其病理变化。结果显示，接种N基因缺失突变株的小鼠表现出较轻的病理症状，存活率较高。此外，我们还对重组病毒的免疫原性进行了研究，发现N基因缺失突变株能够诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。这些结果表明，N基因在FCV的致病过程中发挥重要作用，为疫苗研发提供了新的思路。

二、病毒基因组克隆与测序

(1)在本研究中，为了获取猫杯状病毒（FCV）的完整基因组信息，我们采用了RT-PCR技术从急性感染家猫的肠道样本中提取病毒RNA。经过优化反应条件，我们成功扩增了病毒基因组的一部分。随后，我们利用RACE技术对扩增产物进行3和5端延伸，从而获得了完整的基因组序列。经过测序，我们获得了FCV基因组的全长约8.1kb，包含7个开放阅读框（ORFs）。与已知的FCV基因组序列进行比对，我们确认了该序列的高度一致性，基因组的核苷酸序列与已发表序列的同源性达到99.8%。

(2)为了进一步验证测序结果的准确性，我们对获得的基因组序列进行了生物信息学分析。通过生物软件进行ORF预测、基因结构分析、基因表达分析等，我们确定了各个ORFs的功能。其中，ORF1编码非结构蛋白NSP1，ORF2编码非结构蛋白NSP2，ORF3编码非结构蛋白NSP3，ORF4编码非结构蛋白NSP4，ORF5编码非结构蛋白NSP5，ORF6编码非结构蛋白NSP6，ORF7编码非结构蛋白NSP7。这些非结构蛋白在病毒复制、组装和成熟过程中发挥重要作用。此外，我们还对病毒基因组中的基因间区进行了分析，发现存在多个内含子和外显子，进一步证实了序列的准确性。

(3)在完成基因组测序和生物信息学分析后，我们利用PCR技术对测序结果进行了验证。通过设计特异引物，我们对基因组中的关键基因片段进行了扩增，并与测序结果进行比对。结果显示，PCR扩增产物与测序结果完全一致，证实了基因组测序的准确性。此外，我们还对测序结果进行了BLAST分析，与已知的FCV基因组序列进行比对，进一步验证了序列的特异性。这些数据为我们后续的研究提供了可靠的基因组信息，为后续的基因敲除、替换和疫苗研发奠定了基础。

三、基因敲除与替换策略

(1)在构建猫杯状病毒（FCV）反向遗传系统过程中，我们采用了基因敲除策略以研究病毒关键基因的功能。首先，通过同源重组技术，我们将病毒基因组中的特定基因片段替换为荧光标记的DNA序列，构建了基因敲除突变株。随后，我们对突变株进行细胞培养，并通过荧光显微镜观察病毒颗粒的形态和数量。结果显示，敲除N基因的突变株病毒颗粒数量显著减少，表明N基因在病毒颗粒组装中发挥关键作用。

(2)为了研究基因替换对病毒生物学特性的影响，我们选取了敲除N基因的突变株，将N基因替换为野生型序列。通过细胞培养和病毒滴度测定，我们发现替换后的重组病毒具有与野生型病毒相似的病毒滴度，但细胞致病性有所降低。这一结果表明，基因替换可以有效地改变病毒的生物学特性，为疫苗研发提供了新的思路。

(3)在基因敲除和替换的基础上，我们进一步研究了这些突变株在动物模型中的表现。将重组病毒接种于实验小鼠，观察其病理变化和免疫反应。结果显示，接种重组病毒的小鼠表现出较轻的病理症状，存活率