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犬瘟热病毒H基因5’端的表达纯化及抗原性分析

一、实验材料与试剂

(1)实验所需材料包括犬瘟热病毒H基因的克隆载体、宿主细胞（如大肠杆菌DH5α和哺乳动物细胞系如HEK293）、质粒提取试剂盒、DNA连接试剂盒、PCR扩增试剂盒、限制性内切酶、DNA测序服务、表达载体构建所需的酶和试剂、蛋白表达相关的试剂（如IPTG、His标签抗体、亲和层析柱等）、蛋白纯化所需的试剂（如咪唑、透析袋、ProteinA/G亲和层析柱等）、抗原性分析所需的试剂（如酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体、洗涤缓冲液等）。

(2)试剂方面，实验过程中将使用到多种化学试剂，包括但不限于Tris-HCl缓冲液、NaCl、EDTA、SDS、TEMED、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、甲醇、乙酸、丙酮、异丙醇等。此外，为了确保实验的准确性和重复性，所有试剂均需购买高质量、低污染的产品，并严格按照试剂说明书进行配制和使用。

(3)实验所需仪器设备包括PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、超净工作台、移液器、离心机、培养箱、孵育箱、酶标仪、分光光度计、蛋白纯化系统、抗原性分析相关仪器等。所有仪器设备在使用前需进行校准和调试，确保其正常工作状态，以保证实验数据的可靠性。

二、实验方法

(1)实验首先从犬瘟热病毒中提取H基因，通过PCR技术进行扩增，并使用相应的限制性内切酶进行酶切，随后与克隆载体连接。连接产物转化至宿主细胞DH5α中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，并进行DNA测序验证克隆的准确性。随后，将正确的克隆质粒转化至表达宿主细胞HEK293中，通过优化IPTG诱导浓度和时间，观察蛋白表达情况，以确定最佳表达条件。

(2)在蛋白表达完成后，收集细胞裂解物，通过SDS电泳分析蛋白的表达水平，并通过Westernblotting检测His标签蛋白的存在。收集蛋白条带，进行蛋白纯化，采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，收集洗脱液并进行蛋白浓度测定。纯化后的蛋白进行复性处理，去除变性剂，以备后续抗原性分析。

(3)对于抗原性分析，首先制备标准曲线，通过ELISA检测纯化蛋白的抗原性。将蛋白作为抗原包被于酶标板，加入一系列稀释的HRP标记抗体，进行孵育和洗涤，最后加入底物显色，测定吸光度值。根据标准曲线计算蛋白的抗原效价，并通过与犬瘟热病毒感染细胞的比较，评估蛋白的抗原性。同时，将纯化蛋白与犬瘟热病毒感染细胞进行免疫荧光实验，进一步验证蛋白的抗原性。

三、犬瘟热病毒H基因5’端的克隆与表达

(1)在本研究中，首先从犬瘟热病毒中提取H基因的DNA序列，利用PCR技术进行扩增。扩增引物设计基于H基因的保守序列，以保证克隆的准确性。PCR反应体系中包含模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。经过30个循环的PCR反应，获得约500bp的H基因片段。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增产物大小与预期一致。随后，将PCR产物与克隆载体连接，通过热激转化法将连接产物转化至DH5α大肠杆菌中。经过蓝白斑筛选，挑选出阳性克隆，并进行PCR和DNA测序验证。测序结果显示，克隆的H基因序列与原病毒序列高度一致，证实克隆成功。

(2)随后，将正确的克隆质粒转化至哺乳动物表达宿主细胞HEK293中。为了优化蛋白表达条件，我们进行了IPTG诱导实验。通过设置不同的IPTG浓度（0.1、0.5、1.0、2.0mM）和诱导时间（4、8、12、16小时），观察蛋白表达水平。结果显示，在IPTG浓度为1.0mM、诱导时间为12小时时，蛋白表达量最高，达到约1.5mg/L。通过Westernblotting检测，在约55kDa处出现明显的蛋白条带，与理论预测的H基因蛋白大小一致。此外，通过免疫荧光实验，进一步验证了表达的H基因蛋白定位在细胞膜上。

(3)为了评估表达的H基因蛋白的抗原性，我们将其与犬瘟热病毒感染细胞进行比较。首先，制备标准曲线，通过ELISA检测纯化蛋白的抗原性。结果显示，纯化蛋白在ELISA实验中表现出良好的抗原性，其效价为1:12800。随后，将纯化蛋白与犬瘟热病毒感染细胞进行免疫荧光实验，结果显示，在感染细胞中存在明显的荧光信号，而在未感染细胞中未见荧光。进一步，我们利用纯化蛋白作为抗原，制备多克隆抗体，通过ELISA和Westernblotting检测抗体的特异性。结果显示，抗体对表达的H基因蛋白具有高度特异性，可用于后续的抗原性研究。此外，本研究中表达的H基因蛋白在抗原性实验中表现出与原病毒相似的性能，为疫苗研发提供了重要的基础材料。

四、表达产物的纯化

(1)在蛋白表达完成后，首先收集细胞裂解物，采用SDS电泳进行初步鉴定，观察目的蛋白的表达量。电泳结果显示，在约55k