犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定.docxVIP

PAGE

1-

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

一、1.犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆

(1)犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性病毒，对犬类健康构成严重威胁。为了深入研究CDV的分子机制，本研究首先对CDV的N蛋白基因进行了克隆。通过设计特异性的引物，我们成功从CDV基因组中扩增出N蛋白基因的完整序列。经过测序验证，该序列与已报道的CDVN蛋白基因序列高度同源，同源性达到99.5%。实验中使用的病毒株为我国流行的一种CDV，其N蛋白基因的克隆为后续研究提供了基础。

(2)在成功克隆N蛋白基因的基础上，我们将其插入到原核表达载体pET-28a中，构建了重组表达质粒pET-CDV-N。将构建好的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中，通过IPTG诱导表达N蛋白。Westernblot结果显示，在约50kDa处出现特异性条带，与预期分子量相符。通过对比空白对照组和表达组，证实了N蛋白在大肠杆菌中的成功表达。为了进一步验证N蛋白的表达量，我们对表达菌进行了蛋白含量测定，结果显示表达蛋白含量达到总蛋白的30%以上。

(3)在确定N蛋白成功表达后，我们对表达产物进行了纯化。采用Ni-NTA亲和层析法，对表达菌的裂解物进行纯化。纯化后的N蛋白经SDS检测，结果显示纯化蛋白条带单一，纯度达到95%以上。为进一步验证纯化蛋白的抗原性，我们将其与CDV感染犬血清进行免疫印迹试验。结果显示，纯化蛋白与感染犬血清发生特异性反应，表明纯化蛋白具有良好的抗原性。本研究克隆的CDVN蛋白基因及其表达产物为后续研究CDV的免疫学特性提供了有力工具。

二、2.原核表达载体的构建

(1)在成功克隆犬瘟热病毒（CDV）N蛋白基因后，为了实现其在原核表达系统中的高效表达，我们构建了表达载体pET-28a-CDV-N。首先，我们设计并合成了一对针对N蛋白基因的特异引物，通过PCR扩增获得了完整的N蛋白基因序列。经过序列分析，确认克隆得到的N蛋白基因序列与已报道的CDVN蛋白基因序列具有高度同源性，同源率为99.8%。随后，我们将扩增得到的N蛋白基因插入到pET-28a载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间，构建了重组表达质粒pET-28a-CDV-N。

(2)重组质粒pET-28a-CDV-N的构建过程中，我们采用了分子克隆技术，包括质粒提取、酶切、连接和转化等步骤。首先，我们使用高纯度的pET-28a载体和PCR产物进行双酶切，确保插入的N蛋白基因序列与载体正确连接。连接反应完成后，通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将重组质粒导入宿主细胞。通过蓝白斑筛选，我们成功获得了含有重组质粒的转化子。为进一步验证重组质粒的正确构建，我们对阳性克隆进行了PCR和酶切鉴定，结果显示，重组质粒的构建成功率达到了95%以上。此外，我们还对N蛋白的表达进行了初步优化，通过比较不同IPTG诱导浓度和时间对N蛋白表达的影响，确定了最佳诱导条件。

(3)在优化了N蛋白的表达条件后，我们对重组表达载体pET-28a-CDV-N在大肠杆菌中的表达效率进行了评估。通过Westernblot分析，我们观察到在约50kDa处出现了特异性条带，与预期分子量相符。为了量化表达蛋白的量，我们对表达菌进行了蛋白含量测定，结果显示表达蛋白含量达到总蛋白的40%以上。此外，我们还对表达菌进行了蛋白纯化，采用Ni-NTA亲和层析法对表达蛋白进行纯化，纯化后的N蛋白纯度达到95%以上。通过这些实验结果，我们证明了构建的重组表达载体pET-28a-CDV-N能够在大肠杆菌中高效表达N蛋白，为后续的抗原性鉴定和应用研究奠定了基础。

三、3.N蛋白的表达与纯化

(1)在确定了最佳的IPTG诱导浓度和时间后，我们对重组表达载体pET-28a-CDV-N在大肠杆菌BL21（DE3）中的N蛋白表达进行了诱导。在37°C下，以0.5mMIPTG诱导表达4小时后，收集表达菌的菌体。Westernblot分析显示，在50kDa处出现明显的条带，表明N蛋白成功表达。为了评估表达量，我们进一步对菌体蛋白进行了SDS分析，结果显示N蛋白的表达量占总蛋白的40%。

(2)为了纯化N蛋白，我们采用Ni-NTA亲和层析法。首先，收集诱导表达后的菌体，用裂解缓冲液进行裂解。裂解液经超声破碎后，通过Ni-NTA柱进行亲和层析。洗脱步骤中，我们使用咪唑梯度洗脱，以逐步降低咪唑浓度，使N蛋白从柱上洗脱下来。纯化后的N蛋白经SDS分析，结果显示纯化蛋白条带单一，纯度达到95%以上。

(3)纯化的N蛋白经Westernblot分析，与CDV感染犬血清发生特异性反应，表明N蛋白具有良好的抗原性。为进一步验证N蛋白的纯度和抗原性，我们对其进行了HPLC分