原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
基于海参环境DNA的海参丰度计算
B.1特异性qPCR扩增引物设计
针对特定海参种类的线粒体COI基因或基因组DNA特异区域设计种特异性qPCR扩增引物，引物设计
的原则为：引物特异性强，长度19bp～22bp，GC含量40%～60%，碱基分布均匀，扩增片段长度为150bp～
200bp。
B.2PCR扩增、质粒构建及质粒标准模板制备
以目标海参的DNA为模板，进行常规的海参特异性PCR扩增，进行PCR产物纯化，采用常规的方法进
行PCR产物克隆与质粒转化，提取质粒，溶于50μLddHO中，-20℃保存，测量质粒的浓度。质粒拷贝数
2
计算公式为：
23
=6.02×10××0.66×················································(B.1)
式中：
ST——质粒拷贝数，单位为拷贝/μL；
CON——质粒检测浓度，单位为μg/μL；
NT——质粒碱基数量，单位为bp。
B.3DNA标准定量曲线制作
12345678
将质粒分别稀释至10、10、10、10、10、10、10和10拷贝/μL，作为标准模板，模板量为1μL，
进行常规qPCR扩增，以测得的Ct值为纵坐标，以质粒模板拷贝数的对数为横坐标，绘制目标海参DNA标
准定量曲线。
B.4环境DNA的qPCR扩增及海参丰度计算
B.4.1环境DNA提取
使用标准的采水器收集海参生态增殖海域的底层海水，每个点采集500mL海水样品，使用0.22μm滤
膜对底层海水进行过滤，剪碎滤膜，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒对滤膜上的生物样本进行
DNA提取，提取后的DNA溶于50μLddHO中，-20℃保存，作为环境DNA。
2
B.4.2环境DNA的qPCR扩增及特定种类海参DNA的定量
以1μL上述提取的环境DNA为模板，进行常规qPCR扩增，扩增体系为20μL，测量样品Ct值，通过标准
曲线，求得Ct值所对应的模板中特定种类海参DNA的拷贝数。
B.4.3基于环境DNA的海参丰度计算
在调查海域设置采样点6个，采集采样点的海域底层海水500mL，提取环境DNA，并按照本文件B.4.2
的方法对样品中特定种类海参的DNA进行定量，分别计为DSC1～DSC6，调查海域特定种类海参DNA的平均
拷贝数（DSC）即为特定种类海参环境DNA的丰度值，DSC的计算公式为：
()⁄
=+++++6···································(B.2)
123456
式中：
DSC——调查海域特定种类海参DNA的平均拷贝数，单位为拷贝/mL；
DSC1～DSC6——调查海域第1个～6个采样点特定种类海参DNA的拷贝数，单位为拷贝/mL。
文档评论（0）