细胞生物学技术一.ppt

*倒置相差显微镜1，物镜朝上2，工作距离大3，相差干涉第63页，共105页，星期日，2025年，2月5日*5，培养器皿第64页，共105页，星期日，2025年，2月5日*培养板与培养瓶第65页，共105页，星期日，2025年，2月5日*5，恒温水浴箱，血清灭活，细胞解冻第66页，共105页，星期日，2025年，2月5日*6，移液管第67页，共105页，星期日，2025年，2月5日*第68页，共105页，星期日，2025年，2月5日*第69页，共105页，星期日，2025年，2月5日*7，低速离心机第70页，共105页，星期日，2025年，2月5日*（三）细胞培养基干粉培养基和液体培养基常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等第71页，共105页，星期日，2025年，2月5日*Gibco干粉培养液液体培养液1，培养在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3,丙酮酸钠、抗生素等第72页，共105页，星期日，2025年，2月5日*Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根据需要的量进行分装，避免反复冻融，血清保存要放置－20℃第73页，共105页，星期日，2025年，2月5日*培养液的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考选择培养这种细胞首选的培养液。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。其它实验室惯用的培养液不妨一试，许多培养液可以适合多种细胞。用多种培养液培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIMV培养基（SFM）。第74页，共105页，星期日，2025年，2月5日*血清使用注意事项血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活（heat-inactivation）是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物显著增多，且会影响血清之品质。勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质第75页，共105页，星期日，2025年，2月5日*补体系统原指血清中引起免疫性细胞溶解（抗体包裹细胞溶解）的不耐热因子；现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能相关系统。补体系统主要的功能是通過在病原体表面的作用，破坏其细胞膜或者“调理”病原体表面供巨噬细胞吞食，此外还能引起发炎反应。加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。第76页，共105页，星期日，2025年，2月5日*凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。

显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。血清沉淀物第77页，共105页，星期日，2025年，2月5日*谷氨酰胺L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形