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ICS07.100.30
B20
备案号:41841-2014DB22
吉林省地方标准
DB22/T2053—2014
饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法
DeterminationofAspergillusnidulansinfeedstuffsReal-timePCRmethod
2014-02-28发布2014-04-30实施
吉林省质量技术监督局发布
DB22/T2053—2014
前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。
本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。
本标准主要起草单位:吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华
人民共和国吉林出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。
T
DB22/T2053—2014
饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法
1范围
本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检验方法。
本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T13092饲料中霉菌总数的测定
GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR
实时荧光聚合酶链式反应。
3.2
Ct值cyclethresholdvalue
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4原理
对样品的培养物进行DNA提取,通过实时荧光PCR扩增,观察实时荧光PCR的增幅曲线,从而对饲
料中的构巢曲霉进行快速检测。
5试剂
除特别说明以外,所有试剂均为分析纯,水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA
酶污染的容器分装。
5.1引物及探针:
a)上游引物:5’-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’
b)下游引物:5’-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’
1
DB22/T2053—2014
c)探针:5-FAM-TCAACGGTGACACCCGCTCTT-TAMRA-3’
5.2TaqDNA聚合酶。
5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinatriphosphate,
脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidine
triphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。
5.4真菌基因组DNA提取纯化试剂盒。
5.510×PCR缓冲液:含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KCl),15mmol/L氯
化镁(MgCl₂)。
5.6高盐察氏培养基:
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