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埃博拉出血热检疫技术规范

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SN/T5758—2024

6仪器和设备

6.1PCR扩增仪。

6.2荧光定量PCR仪。

6.3水平电泳仪。

6.4凝胶成像仪。

6.5普通冰箱和-80℃冰箱。

6.6低温冷冻离心机(可控温至4℃,离心速度可达12000g以上)。

6.7二级生物安全柜。

6.8高压灭菌锅。

6.9微量可调移液器(2μL,10L,100L,1000L)及配套带滤芯吸头。

7试剂和材料

在检测中使用的试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的一级水的要求。

7.1Trizol。

7.2DEPC处理水(见B.1)。

7.3PBS:0.1mol/L(见B.2)。

7.4三氯甲烷。

7.5异丙醇：使用前-20℃预冷。

7.675%乙醇：用DEPC水和无水乙醇配制，使用前-20℃预冷。

7.7溴化乙锭(EB):10mg/mL,使用浓度为05temL.

7.8TagDNA酵：-20℃保存。

7.9dNTPs:含dCTP、dGTP、dATPdITTP各10mmolL的混合物，-20℃保存。

7.10AMV逆转录酶：-20℃保存。

7.11琼脂糖。

7.12DNAMarker(100.-20006p)

7.13TBE电泳缓冲液(见23)。

7.14上样缓冲液。

7.152x荧光PCR预混液。

8检验程序

8.1样品采集、保存及运输

样品的采集按照GB/T18088执行。样品温度应保持在0℃以下。样品的保存和运输的生物安全要求参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》的有关要求执行

8.2实验室检测

8.2.1样品处理

组织样品先去除包膜和其他结绪组织，选取内部实质部分，置研钵中，加入石英砂充分研磨，

然后按照1:5比例加入0.1mol/LPBS(pH7.6-pH7.8)。4℃浸泡过夜或者-20℃反复冻融2次，每

次30min,4℃条件下以8000g离心5min,取上清进行后续操作。

液体样品如血液、尿液、唾液不必经过研磨或冻融处理，直接进行后续操作。不能立即进行检测

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时，样本冻存于-70℃左右超低温冰箱备用。

8.2.2病毒核酸提取

8.2.2.1Trizol法

取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL,再加人200pL三氧甲烷，紧盖离心管，混匀器上振荡混匀15s后室温静置5min,于4℃12000g离心15min。取新的灭菌的1.5mL离心管，加入-20℃预冷400L异丙醇，吸取离心后将各管中的上清液转移至预冷的异丙醇中，避免吸出中间层，颅倒混匀。于4℃12000g离心15min,弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，加入600μL75%预冷乙醇，颠倒洗涤。于4℃12000g离心10min,弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，室温干燥5min~10min。

加入15μL~20μLDEPC水，溶解管底的RNA,5000g离心5s,冰上保存备用，若长期保存应放置在-70℃冰箱。

8.2.2.2核酸提取等效方法

埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法，如采用商品化试剂盒或自动化核酸抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。

8.2.3阳性对照、阴性对照和空白对照

检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据埃博拉病毒核苷酸序列通过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA.以及包含埃博拉病毒NP或GP基因的假病毒，阴性对照可选择其他类病毒的核酸样本，空自对照为无菌水作为扩增模板。

8.2.4RT-PCR检测方法

8.2.4.1检测引物

NP基因扩增引

上游引物NPF75