DB3301_T 1120-2023 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR标记法.docx

ICS65.020.01CCSB05

3301

浙江省杭州市地方标准

DB3301/T1120—2023

三叶青种质资源鉴定技术规程SSR标记法

2023-02-28发布2023-03-28实施

杭州市市场监督管理局发布

DB3301/T1120—2023

I

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5仪器设备及试剂 1

6溶液配制 3

7操作程序 3

8判定方法 4

附录A（规范性）溶液配制 6

附录B（资料性）推荐引物 8

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II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由杭州市农业农村局提出、归口并组织实施。

本文件起草单位：杭州市农业科学研究院、杭州市农业农村事务保障中心。

本文件主要起草人：严建立、黄雨晴、阮松林、钱丽华、应武、陆秋君、蔡和平。

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1

三叶青种质资源鉴定技术规程SSR标记法

1范围

本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats,SSR）标记进行三叶青（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg）不同种质资源鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序及判定方法。

本文件适用于三叶青种质资源SSR指纹数据采集及种质资源鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

引物primer

在核酸合成反应时，作为多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的一小段单链脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA）或核糖核酸（RibonucleicAcid，RNA）。

3.2

参照种质资源referencegermplasmresource

具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照种质资源用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。

注：本文件选用的参照品种为：三叶青2012-1。

4原理

由于不同三叶青种质资源遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列（SSR）的重复次数有差异，从而使得不同种质资源中的简单重复序列长度存在差异。这种差异可以通过聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同种质资源。

5仪器设备及试剂

5.1一般规定

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2

本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682—2008中规定的三级水。

5.2仪器设备

本方法中所用的仪器设备包括：

a)普通电泳仪；

b)垂直电泳槽及配套的制胶附件；

c)水浴锅；

d)水平摇床；

e)高速冷冻离心机（最大离心力不小于20000g）；

f)电子天平（精度为千分之一）；

g)微量移液器（量程分别为10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）；

h)pH计；

i)冰箱（4℃和-20℃);

j)磁力搅拌器；

k)核酸定量测定仪；

l)微波炉；

m)高压蒸汽灭菌锅；

n)制冰机；

o)组织破碎仪；

p)凝胶成像系统；

q)超纯水仪。5.3所用试剂

本方法中所用的试剂包括：

a)十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB）；

b)三氯甲烷；

c)异戊醇；

d)异丙醇；

e)乙醇；

f)乙二胺四乙酸二钠；

g)三羟甲基氨基甲烷；

h)SSR引物；

i)DNA标准分子量标记（marker）；

j)5×PCR预混液Pre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示剂）；

k)琼脂糖；