常用的工具酶课件.pptx

01小节PART常用的工具酶

工具酶定义DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被称为工具酶。

主要的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶逆转录酶DNA聚合酶Ⅰ碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶

1.1限制性内切酶限制性内切酶简称限制酶，是DNA重组技术的基本工具，是识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶。

Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶兼有修饰作用和依赖于ATP的限制活性在DNA重组技术中并不常用Ⅱ类限制性内切酶能识别并切割特异性的核苷酸序列通常所说的限制性内切酶即指此类（一）分类（根据酶的分子组成及裂解方式的不同）

（二）2.Ⅱ类限制性核酸内切酶作用特点切口平端切口--平末端粘端切口--粘性末端GGATCCCCTAGG回文结构

BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口

DNA的纯度和结构、缓冲溶液pH值、离子浓度、酶解温度和时间、限制性内切酶本身够会影响限制性核酸内切酶的活性（三）影响酶活性的主要因素

1.2DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子。连接反应需要ATP、Mg2+和二硫苏糖醇，最适pH为7.2～7.4，ATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率。

1.2DNA聚合酶特点模板引物3’-OH常见DNA聚合酶I、Klenow片段、耐热TaqDNA聚合酶、T4DNA聚合酶以DNA为模板、脱氧核苷酸为原料，催化合成DNA

DNA聚合酶Ⅰ主要应用合成双链DNA分子缺口平移法，获得高比活性探针DNA序列分析补平3′端

定义Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ大片段，具有完整的DNA聚合酶活性，保留3′→5′外切酶活性，无5′→3′外切酶活性。应用合成cDNA第二链补齐双链DNA分子3′端或标记3′端DNA序列分析Klenow片段

TaqDNA聚合酶主要应用PCR扩增目的DNA片段DNA序列分析目的DNA片段3′端加A，用于A－T克隆