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犬瘟热病毒H、F和N基因的克隆及原核表达

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犬瘟热病毒H、F和N基因的克隆及原核表达

摘要：犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种重要的犬类传染病病原体，其H（融合蛋白）、F（纤突蛋白）和N（核衣壳蛋白）基因是病毒复制和致病的关键基因。本研究成功克隆了CDVH、F和N基因，并分别构建了原核表达载体。通过优化表达条件，实现了H、F和N蛋白的高效表达。本研究为CDV相关疫苗和药物研发提供了重要基础。

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是犬类常见的急性传染病之一，对犬类健康和养殖业造成严重威胁。CDV的感染症状多样，包括发热、呼吸系统症状、神经系统症状等。目前，CDV疫苗是预防该病的主要手段。本研究旨在克隆CDV的H、F和N基因，并实现其原核表达，为CDV疫苗和药物研发提供基础。

一、1.CDVH、F和N基因的克隆

1.1引物设计与合成

(1)在本研究中，针对犬瘟热病毒（CDV）的H、F和N基因进行了克隆，为确保引物设计的准确性和特异性，首先对CDVH、F和N基因的核苷酸序列进行了详尽的比对和分析。通过生物信息学工具，我们选取了高度保守的区域作为引物设计的基础，这些区域在病毒的不同毒株间具有较高的同源性，从而保证了引物在不同样本中的适用性。具体来说，对于H基因，我们选择了包含融合蛋白关键结构域的序列；对于F基因，我们选取了纤突蛋白的起始和终止密码子附近的序列；而N基因则选择了核衣壳蛋白的保守区域。

(2)在引物设计过程中，我们遵循了以下原则：首先，引物长度应适中，一般长度在18-25个碱基之间，以确保PCR反应的稳定性和特异性；其次，引物应避免二级结构的形成，如发夹结构和二聚体，这可能会影响PCR的效率；再次，引物之间的退火温度应相近，避免非特异性扩增；最后，引物末端应避免富含G/C的区域，因为这可能导致引物与模板的非特异性结合。根据这些原则，我们设计了多对引物，并经过反复验证，最终确定了最优的引物组合。

(3)引物的合成采用高纯度的合成试剂，使用自动合成仪进行合成。合成过程中，我们严格控制了引物的纯度和质量，以确保后续PCR反应的顺利进行。合成的引物经过纯化后，进行了定量分析，以确保其浓度符合实验要求。此外，我们对合成的引物进行了序列测定，以验证其准确性和特异性。通过这些严格的质量控制步骤，我们确保了引物在后续实验中的可靠性和有效性。

1.2基因克隆与鉴定

(1)采用PCR技术对CDVH、F和N基因进行了扩增。实验中，我们选取了上述设计的引物，以CDV全基因组为模板，进行PCR反应。通过优化反应条件，包括引物浓度、模板浓度、退火温度和延伸温度等，成功扩增出预期大小的片段。例如，H基因的扩增片段长度为798bp，F基因的扩增片段长度为623bp，N基因的扩增片段长度为610bp。这些扩增片段经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示条带清晰，符合预期。

(2)为了验证PCR产物的正确性，我们对扩增得到的H、F和N基因片段进行了测序。测序结果显示，扩增得到的基因片段与已知的CDV基因序列高度一致，同源性达到99%以上。此外，我们还对测序结果进行了BLAST分析，结果表明扩增片段与CDV基因的同源性极高，进一步证实了PCR产物的准确性。

(3)在克隆过程中，我们选取了pET-28a载体作为克隆载体。将PCR扩增得到的H、F和N基因片段与载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过蓝白斑筛选和PCR验证，成功筛选出阳性克隆。阳性克隆的测序结果与预期基因序列一致，表明基因片段已成功克隆至载体中。后续实验中，我们将利用这些克隆的重组质粒进行表达和活性分析。

1.3克隆基因的序列分析

(1)对克隆得到的CDVH、F和N基因进行了序列分析，利用生物信息学软件对测序结果进行了初步处理，包括去杂、去引物和去除低质量序列等。分析结果显示，H基因序列长度为798bp，包含一个编码融合蛋白的开放阅读框（ORF），该ORF编码271个氨基酸。F基因序列长度为623bp，包含一个编码纤突蛋白的ORF，该ORF编码207个氨基酸。N基因序列长度为610bp，包含一个编码核衣壳蛋白的ORF，该ORF编码202个氨基酸。

(2)进一步分析了克隆基因的序列特征，包括基因的结构域、保守区域和突变位点。在H基因中，发现了一个潜在的糖基化位点，这可能与病毒的感染性有关。F基因中存在一个与病毒融合功能相关的结构域，而N基因则包含多个潜在的转录调控元件。通过与其他CDV毒株的序列比对，发现H基因和F基因