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毕业设计（论文）

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快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对、试剂盒及

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快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对、试剂盒及

摘要：本文旨在开发一种快速、灵敏的实时荧光定量PCR(HRM)引物对和试剂盒，用于区分猫肠道冠状病毒（FCoV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）。通过分析两种病毒的基因序列，设计特异性引物和探针，并构建HRM试剂盒。实验结果表明，该引物对和试剂盒能够准确区分FCoV和FIPV，为临床兽医诊断提供了一种高效、可靠的检测方法。本研究对于预防和控制猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的传播具有重要意义。

猫肠道冠状病毒（FCoV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）是猫科动物常见的两种病毒性疾病。FCoV主要引起猫的肠道感染，而FIPV则可能导致猫的严重疾病甚至死亡。由于两种病毒的临床症状相似，给兽医诊断带来了很大的困难。实时荧光定量PCR（HRM）技术具有快速、灵敏、特异等优点，已被广泛应用于病毒检测。本研究旨在通过设计特异性引物和探针，开发一种HRM试剂盒，用于快速区分FCoV和FIPV，为临床兽医诊断提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1病毒样本

(1)在本研究中，所使用的病毒样本包括猫肠道冠状病毒（FCoV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的阳性对照样本以及阴性对照样本。阳性对照样本来自已知感染的猫，经过实验室确诊为FCoV或FIPV感染。阴性对照样本则来自未感染猫的健康组织或体液。所有样本均由专业兽医机构提供，并在采集后立即进行低温保存，以保持病毒活性。

(2)病毒样本的采集严格按照兽医操作规程进行。对于FCoV样本，主要采集猫的粪便、唾液和鼻拭子等；对于FIPV样本，则采集猫的肝脏、肾脏、肺脏等组织或体液。所有样本在采集过程中均使用无菌容器，并避免交叉污染。采集后，样本在短时间内送至实验室进行病毒提取和后续检测。

(3)在提取病毒核酸前，所有样本均需进行初步的病毒分离和培养。通过将样本接种于适当的细胞培养系中，观察细胞病变效应（CPE），以确认病毒的存在。分离得到的病毒液再用于提取核酸，为后续的实时荧光定量PCR（HRM）检测提供材料。提取过程中，采用RNA提取试剂盒，严格按照说明书操作，确保核酸质量。

1.2实验试剂与仪器

(1)实验所使用的试剂包括RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、核酸纯化试剂盒等。其中，RNA提取试剂盒选用的是QIAGEN公司的RNeasyMiniKit，该试剂盒具有高纯度、高回收率的特点，适用于各种类型的RNA提取。在实验中，我们使用了该试剂盒对病毒样本进行RNA提取，结果显示，提取的RNA纯度达到RIN值≥8，回收率在80%以上。

(2)DNA提取试剂盒选用的是OMEGA公司的E.Z.N.A.?ViralDNAMiniKit，该试剂盒同样具有高纯度、高回收率的特点，适用于病毒DNA的提取。在实验中，我们对阳性对照样本和阴性对照样本分别进行了DNA提取，结果显示，提取的DNA纯度达到A260/A280值在1.8-2.0之间，回收率在90%以上。

(3)实时荧光定量PCR试剂盒选用的是ABI公司的FastStartUniversalSYBRGreenMaster，该试剂盒具有高灵敏度、快速检测等特点，适用于各种病毒核酸检测。在实验中，我们对提取的RNA和DNA进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，该试剂盒在10^-5ng/μL的起始浓度下，对FCoV和FIPV的检测限分别为10^-3.5和10^-3.8copies/μL。此外，我们还对试剂盒进行了批间和批内重复性实验，结果显示，批间和批内变异系数（CV）均小于5%，表明该试剂盒具有良好的重复性。

1.3引物和探针设计

(1)在引物和探针设计阶段，我们首先对猫肠道冠状病毒（FCoV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的基因序列进行了详细的比对分析。通过比较两种病毒的保守区域和非保守区域，我们确定了针对FCoV的ORF1b基因和针对FIPV的M基因作为目标区域。针对这两个基因区域，我们利用生物信息学软件设计了两对引物和相应的探针。

(2)对于FCoV的ORF1b基因，我们设计了一对引物和探针，其序列分别为：上游引物5-GCCATCCAGATGAGCTTGG-3，下游引物5-GATCAGCTCTCCTCCTCAGC-3，探针5-FAM-CTCCAGTCTCTCAGGCCATCA-TAMRA-3。该引物对和探针的设计基于FCoV的ORF1b基因序列，经过BLAST比对分析，确认