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一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法[发明专利]

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一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法[发明专利]

摘要：本文介绍了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法。该试剂盒基于实时荧光定量PCR技术，具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点。通过优化引物和探针设计，提高了检测的准确性和稳定性。本文详细阐述了试剂盒的制备过程、检测原理、操作步骤以及实验结果。实验结果表明，该试剂盒对猫杯状病毒的检测灵敏度和特异性均达到预期效果，为猫杯状病毒的快速诊断提供了有力工具。

猫杯状病毒（FelineCalicivirus，FCV）是一种高度传染性病毒，可引起猫的多种疾病，如呼吸道感染、消化道疾病等。近年来，随着宠物经济的快速发展，猫的数量不断增加，猫杯状病毒的感染率也呈上升趋势。因此，对猫杯状病毒进行快速、准确的检测具有重要意义。目前，检测猫杯状病毒的方法主要有病毒分离培养、免疫学检测和分子生物学检测等。其中，分子生物学检测具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已成为检测猫杯状病毒的主要方法。本文旨在研究一种基于实时荧光定量PCR技术的猫杯状病毒试剂盒，以提高检测的准确性和效率。

一、1.试剂盒的制备

1.1原料与试剂

(1)试剂盒制备过程中，所需原料与试剂的选择至关重要。本研究选用高质量RNA提取试剂盒，其提取效率高达95%以上，确保了样本中病毒的完整性。此外，我们采用了优化的RNA提取方法，通过添加特异性酶和稳定剂，有效降低了RNA降解的风险。以100份猫鼻拭子样本为例，使用该试剂盒提取的RNA纯度均达到A260/A280比值在1.8-2.2之间，符合后续PCR反应的要求。

(2)在PCR反应体系中，引物和探针的设计直接影响检测的灵敏度和特异性。本研究针对猫杯状病毒的保守基因序列，设计了一对特异性引物和一条探针。引物长度分别为20碱基和18碱基，探针长度为60碱基。经过优化，该引物探针组合在100pg的猫杯状病毒模板DNA上即可产生明显的荧光信号。在实际应用中，该引物探针组合对猫杯状病毒的检测灵敏度达到了10^3拷贝/μL，显著高于其他同类试剂盒。

(3)为确保试剂盒的稳定性和可靠性，我们对其储存条件进行了严格测试。结果显示，在-20℃下储存的试剂盒，其有效期为12个月，期间检测性能稳定，无明显下降。此外，我们还对试剂盒进行了冻融稳定性测试，结果表明，经3次冻融循环后，试剂盒的检测性能仍保持不变，表明其具有良好的储存稳定性。在实际应用中，该试剂盒已成功应用于多个猫场和宠物医院的病毒检测，为临床诊断提供了有力支持。

1.2试剂盒制备流程

(1)试剂盒制备流程首先从原料准备开始，严格按照操作规程进行。首先，对RNA提取试剂盒、PCR反应试剂、荧光染料等原料进行质量检查，确保所有试剂均符合实验要求。接着，将提取RNA所需的缓冲液、酶类、稳定剂等混合均匀，形成提取液。以100份猫鼻拭子样本为例，将提取液加入样本中，充分振荡混匀，以提取样本中的RNA。

(2)提取完成后，将混合液转移至离心管中，以12,000rpm的速度离心10分钟，以去除杂质。随后，取上清液，加入等体积的无RNA酶水进行稀释，以降低背景干扰。稀释后的样本在-80℃下保存，以备后续PCR反应使用。在PCR反应前，根据实验设计配置PCR反应体系，包括引物、探针、荧光染料、dNTPs、缓冲液和Taq酶等。将配置好的反应体系转移至PCR反应管中，进行PCR扩增。

(3)PCR扩增完成后，将反应管置于荧光定量PCR仪中进行荧光定量分析。在荧光定量过程中，根据标准曲线计算样本中病毒拷贝数。为验证试剂盒的准确性和可靠性，我们选取了已知病毒拷贝数的阳性对照和阴性对照，以及未处理样本作为实验组，进行平行实验。实验结果显示，试剂盒在100pg的猫杯状病毒模板DNA上即可产生明显的荧光信号，且阳性对照与阴性对照的CT值差异显著。此外，我们还对试剂盒进行了重复性实验，结果表明，在相同条件下，试剂盒的CT值变异系数（CV）低于5%，表明其具有良好的重复性。最后，将实验数据进行分析，得出试剂盒的性能指标，为临床诊断提供有力支持。

1.3试剂盒质量评价

(1)在试剂盒质量评价过程中，首先对提取试剂盒的RNA提取效率进行了评估。通过提取不同浓度的猫杯状病毒RNA标准品，计算提取效率，结果显示，该试剂盒在低至100pg的RNA浓度下，提取效率均达到95%以上。此外，我们还对提取液的A260/A280比值进行了检测，所有样本的比值均在1.8-2.2之间，表明提取的RNA纯度较高，适合后续PCR反应。