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犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

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犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

摘要：犬瘟热病毒（CDV）是一种高度传染性的病毒，对犬类健康构成严重威胁。CDV野毒株与疫苗株的鉴别对于疾病的防控至关重要。本研究旨在建立一种基于环介导等温扩增（RT-LAMP）的快速、准确检测CDV野毒株与疫苗株的方法。通过优化引物设计、反应体系以及扩增条件，成功建立了RT-LAMP检测方法，并通过与实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行对比，证实了该方法具有较高的灵敏度和特异性。本研究为CDV野毒株与疫苗株的快速鉴别提供了新的技术手段，对犬瘟热的防控具有重要意义。

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科。CDV感染犬类后，可引起犬瘟热，其症状包括发热、呼吸道症状、消化道症状以及神经系统症状等。犬瘟热对犬类健康构成严重威胁，且目前尚无特效治疗方法。因此，预防CDV感染尤为重要。CDV疫苗的应用虽然降低了犬瘟热的发病率，但野毒株与疫苗株的鉴别仍然是一个难题。本研究旨在建立一种基于环介导等温扩增（RT-LAMP）的快速、准确检测CDV野毒株与疫苗株的方法，为犬瘟热的防控提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括犬瘟热病毒（CDV）野毒株和疫苗株，其中野毒株为我国某地区分离株，疫苗株为国内某知名品牌的CDV疫苗。野毒株和疫苗株均经过PCR鉴定确认，并采用DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取的DNA浓度为1.0ng/μL，纯度通过NanoDrop?2000分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间，符合实验要求。此外，实验中还使用了阴性对照和阳性对照，阴性对照为未感染CDV的犬类组织DNA，阳性对照为已知感染CDV的犬类组织DNA。

(2)实验所用的引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物序列经过生物信息学分析设计，确保针对CDV基因组的特异性。引物长度分别为20-25碱基，Tm值在60-65℃之间，以确保扩增效率。引物合成后，采用电泳法进行纯化，纯化后的引物浓度约为10μM，纯度通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。

(3)实验过程中所用的试剂主要包括DNA提取试剂盒、RT-LAMP反应试剂盒、qRT-PCR试剂、DNA/RNA纯化试剂盒、DNA/RNA荧光定量试剂盒等。所有试剂均为市售产品，符合实验要求。实验过程中，DNA提取、RT-LAMP扩增、qRT-PCR扩增等步骤均严格按照试剂说明书进行操作。实验所用仪器包括PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、核酸分析仪、分光光度计等。所有实验均在符合生物安全要求的实验室环境中进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。

1.2RT-LAMP引物设计与合成

(1)RT-LAMP引物设计遵循了特异性、保守性和扩增效率的原则。首先，通过生物信息学分析，选取了CDV基因组的保守区域作为靶标序列。针对该区域，设计了两条外引物和六条内引物。外引物分别位于靶标序列的两端，内引物则通过引物环设计，确保在扩增过程中形成LAMP的环状结构。引物序列经过BLAST比对，确保了与CDV基因组的特异性，并与已知的CDV序列无同源性。

(2)引物设计完成后，采用PrimerPremier5.0软件进行引物熔解温度（Tm）和二聚体形成的预测。引物Tm值设定在60-65℃之间，以适应RT-LAMP反应的温度要求。同时，通过分析引物之间的二聚体形成情况，确保了引物之间不会发生二聚化。引物合成后，进行了电泳纯化，以去除未结合的引物和杂质。

(3)引物合成完成后，进行了引物浓度的测定。通过紫外分光光度计检测，引物浓度为10μM，符合实验要求。引物纯度通过A260/A280比值检测，比值在1.8-2.0之间，表明引物纯度高，无杂质。此外，还进行了引物特异性验证，通过RT-LAMP扩增CDV野毒株和疫苗株的DNA，以及未感染CDV的犬类组织DNA，结果显示引物特异性良好，无假阳性结果。

1.3RT-LAMP反应体系与条件优化

(1)RT-LAMP反应体系优化过程中，我们首先考察了不同Mg2+浓度对扩增效率的影响。实验结果显示，随着Mg2+浓度的增加，扩增曲线的Ct值逐渐降低，扩增效率提高。在Mg2+浓度从1.5mM增加到4.5mM时，Ct值从34.5min降低至25.2min，扩增效率提升了约27.2%。然而，当Mg2+浓度继续增加到6.0mM时，扩增效率并未