缝隙连接通道蛋白Cx43介导的星形胶质细胞电偶联在维持小鼠海马钾稳态中的作用研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文

摘要

背景：

星形胶质细胞是脑中数量最多的细胞类型，其最显著的特征是建立起由缝隙连

接通道介导的遍布全脑的合胞体样网络，在神经元工作环境的稳态调节中发挥重要

作用。脑中星形胶质细胞缝隙连接通道蛋白亚型主要是connexin43（Cx43）。星形

胶质细胞缝隙连接在功能上包括代谢偶联和电学偶联，目前的研究主要集中在代谢

偶联功能，对其电偶联特性的研究非常缺乏。我们前期电生理学研究发现，星形胶

质细胞网络存在合胞体等电位特性，即网络内的星形胶质细胞膜电位可以被均衡到

+

相似的准生理水平。星形胶质细胞稳定的负性膜电位是其再摄取胞外K和神经递质

的驱动力来源，同时星形胶质细胞膜电位对细胞外钾离子浓度的改变非常敏感，提

示星形胶质细胞电偶联很可能参与调节细胞外钾稳态。目前关于星形胶质细胞电偶

联的通道基础及其对细胞稳定负性膜电位的贡献尚不清楚，所以我们选择以钾稳态

为切入点，探究Cx43介导的星形胶质细胞电偶联在维持小鼠海马组织细胞外钾稳

态中的作用。

目的：

明确缝隙连接蛋白Cx43是否为星形胶质细胞电学偶联的通道基础，探讨其对

星形胶质细胞静息膜电位的影响，确定星形胶质细胞电偶联在细胞外钾离子稳态维

持中的作用。

方法：

1.利用基因沉默原理，构建含shRNA干扰序列的AAV病毒，靶向沉默星形

胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43表达；

2.釆用脑立体定位注射技术，使小鼠双侧海马CA1区的星形胶质细胞感染

AAV-Scr或AAV-Cx43-shRNA病毒；

3.通过生物胞素Biocytin细胞内扩散法检测星形胶质细胞的偶联情况；

4.通过免疫荧光染色检测Cx43敲减后小鼠海马CA1区形态是否改变；

III

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5.运用离体脑片全细胞膜片钳技术，探究海马CA1区星形胶质细胞基本电学

特性（静息膜电位、电流电压曲线和内向整流系数）；

6.利用蛋白免疫印迹方法检测星形胶质细胞膜主要钾通道和转运体的表达；

7.运用离体脑片全细胞膜片钳技术，测量全Na+内液时星形胶质细胞稳定态膜

电位和缝隙连接电学偶联强度；

8.运用离体脑片全细胞膜片钳技术，记录并观察星形胶质细胞膜电位稳定性，

灌流含不同抑制剂的外液确定星形胶质细胞膜电位失去稳定的诱因；

9.结合钾敏感电极制作技术与离体脑片全细胞膜片钳技术，测量敲减Cx43之

后的细胞外钾波动；

10.运用离体脑片全细胞膜片钳技术，使用0Mg2+/PTX灌流脑片，观察诱导

神经元出现的癫痫样放电活动。

结果：

1.成功特异性敲减海马CA1区星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达；

2.敲减海马星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43不改变CA1区形态；

3.敲减海马星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43不改变其基本电学特性；

4.敲减海马星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43后，使用全钠内液时星形胶质细胞膜

电位去极化程度明显增加，即稳定态膜电位VM,SS更偏正，VM,I和VM,SS的差值

ΔV显著增大，Cx43-shRNA组相对偶联强度S%约降至正常时一半，表明其电学

偶联强度减弱；

5.Cx43-shRNA组静息膜电位存在明显波动，约一半记录呈现Burst-like型膜电

位，膜电位变化值与WT组、Scr组相比显著增大，膜电位曲线下面积亦显著增

大，说明敲减海马CA