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犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究

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犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究

摘要：犬瘟热病毒（CDV）是犬类常见的一种高度传染性疾病，其强毒株HBF-1株具有高度的致病性和致死性。本文旨在研究犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育方法，并通过实验研究其在犬类动物中的致病性。首先，通过细胞培养和传代技术，成功培育出HBF-1株。接着，通过病毒滴度测定、细胞病理学观察、免疫荧光技术等方法，对HBF-1株的病毒滴度、致病性和免疫原性进行了系统研究。结果表明，HBF-1株具有高病毒滴度，能够引起犬类动物的明显病理变化，并且具有较好的免疫原性。本研究为犬瘟热病毒的防控提供了理论依据和实验基础。

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科，主要感染犬类。犬瘟热是一种高度传染性疾病，对犬类健康和养犬业发展造成严重威胁。犬瘟热病毒强毒株HBF-1株具有高度的致病性和致死性，已成为犬瘟热防控的重点研究对象。本研究旨在通过培育HBF-1株，并对其致病性进行研究，为犬瘟热的防控提供理论依据和实验基础。

一、犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育

1.细胞培养与传代技术

(1)细胞培养技术是病毒学研究中不可或缺的一环，对于犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育，我们采用了犬肾细胞（MDCK）作为培养细胞。MDCK细胞具有易培养、生长速度快、易于传代等优点，是病毒培养的常用细胞系。在实验过程中，我们将MDCK细胞接种于直径为75mm的培养皿中，细胞密度控制在每皿约1×10^6个细胞。经过24小时的适应期后，细胞开始贴壁生长，此时我们开始进行病毒接种。病毒接种量根据病毒滴度调整，通常为每皿100μl，接种后置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

(2)在病毒接种后的24小时内，我们开始观察细胞的变化。随着病毒的感染，细胞出现明显的病变，包括细胞变圆、脱落、细胞间连接减少等。为了确保病毒的有效感染，我们通过显微镜观察细胞病变情况，当至少80%的细胞出现病变时，我们认为病毒感染达到最大效应。随后，我们收集感染细胞，并通过反复冻融法提取病毒，以去除细胞碎片和未感染病毒。提取的病毒通过滴度测定进一步验证其活性，确保后续实验中使用的是高滴度病毒。

(3)在病毒培养过程中，为了维持细胞的活力和生长状态，我们定期更换新鲜培养基。培养基的更换频率根据细胞生长状况和实验需求进行调整，通常每隔2-3天更换一次。在细胞传代过程中，我们采用酶消化法将细胞从培养皿中剥离，然后通过离心去除消化酶和细胞碎片。随后，我们将细胞悬浮在新鲜培养基中，以每1×10^6个细胞/100μl的比例接种于新的培养皿中。通过这种方式，我们成功实现了HBF-1株的连续传代培养，并保持了病毒的稳定性和活性。在传代过程中，我们对细胞形态、生长速度和病毒滴度进行监测，确保实验数据的准确性。

2.病毒分离与纯化

(1)病毒分离与纯化是研究病毒特性的关键步骤。对于犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的分离，我们采用了感染犬肾细胞（MDCK）的样品。样品处理过程中，首先将感染细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后收集细胞悬液。接着，通过低速离心去除细胞碎片和杂质，得到细胞上清液。细胞上清液经过0.45μm滤膜过滤，以去除可能存在的细菌和颗粒物。

(2)在病毒纯化阶段，我们采用连续两轮的蔗糖密度梯度离心法。首先，将过滤后的细胞上清液与等体积的5%蔗糖溶液混合，形成病毒悬液。随后，将悬液加入装有线性梯度蔗糖溶液的离心管中，以4,000rpm的速度离心2小时。离心后，病毒颗粒会根据密度分布在蔗糖梯度中。使用紫外分光光度计检测各层的光密度（OD），确定病毒颗粒所在层。将病毒颗粒层收集，并通过进一步过滤和离心去除未结合的蔗糖和杂质。

(3)最后，为了确保病毒颗粒的纯度和活性，我们进行了病毒滴度测定。将纯化后的病毒颗粒重新悬浮于适当的培养基中，然后进行滴度实验。通过接种MDCK细胞，观察细胞病变效应（CPE），计算病毒滴度。实验结果显示，纯化后的HBF-1株病毒滴度达到10^7.5TCID50/ml，表明病毒纯化效果良好，可用于后续的致病性和免疫学实验。

3.病毒滴度测定

(1)病毒滴度测定是评估病毒样品中病毒颗粒数量的关键步骤。在测定犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的滴度时，我们采用了50%组织细胞感染剂量（TCID50）方法。首先，将病毒样品进行10倍系列稀释，从10^-1到10^-8。每个稀释度取100μl接种于96孔细胞培养板中，每孔接种3个复孔。接