生化技术蛋白质酶抗体标记.ppt

1.切口平移法制备生物素酰化的探针此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每1kbDNA可掺入约50个生物素分子第25页，共79页，星期日，2025年，2月5日2.随机引物介导法制备生物素酰化探针第26页，共79页，星期日，2025年，2月5日（三）两种新标记法扫若仑标记和分子灯塔探针第27页，共79页，星期日，2025年，2月5日1.扫若仑标记扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可达fg级别）扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320~400nm的紫外光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若仑衍生物的含量与核酸中胸苷（dT）或尿苷（U）的含量成正比关系第28页，共79页，星期日，2025年，2月5日第29页，共79页，星期日，2025年，2月5日2.分子灯塔探针概念用新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸的核酸探针特征①由25个核苷酸组成②灯中间环形的15个核苷酸与靶DNA是互补序列；灯竿一端的5个核苷酸与另一端的5个核苷酸是互补③在5’和3’端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧光素（熄灭剂）第30页，共79页，星期日，2025年，2月5日第31页，共79页，星期日，2025年，2月5日分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶DNA或RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相互分离，产生荧光第32页，共79页，星期日，2025年，2月5日三、核素标记标记核酸的核素有32P、33P、35S和3H。其中32P是制备高比活度放射性探针常用的一种同位素；33P比32P使用安全；35S能量低，不会引起核酸损伤，常用于制备稳定的比活度低的探针，但对许多酶的活性有影响；3H标记的探针常用于原位杂交、核酸的合成和降解分析由于不同放射性同位素对人体伤害和环境污染程度不同，因此实际操作时根据检测要求结合实验室条件选择相应的标记方法第33页，共79页，星期日，2025年，2月5日（一）双链DNA探针1.切口平移法原理类似于非核素DIG标记中的切口平移法，所不同的是，此处用高放射活性标记的核苷酸置换原来的核苷酸操作要点将DNase和E.coli-DNA-polⅠ催化的反应分开进行，这样可避免DNase在聚合反应过程中降解DNA第34页，共79页，星期日，2025年，2月5日第35页，共79页，星期日，2025年，2月5日2.随机引物介导法方法与DIG-随机引物介导法制备DNA探针相似，即用DNase水解小牛胸腺DNA（或鲑鱼精DNA），产生6~12核苷酸的单链DNA或随机6聚合体核苷酸的混合物作为引物；以变性的闭环DNA或线性DNA作为模板，在klenow片段的催化作用下，介导产生DNA探针分为游离DNA片段为模板和固定DNA片段为模板制备探针第36页，共79页，星期日，2025年，2月5日（1）以游离DNA片段为模板制备探针模板DNA用限制性内切酶消化，电泳纯化或乙醇沉淀后，与其他试剂混合制备探针第37页，共79页，星期日，2025年，2月5日（2）以固定DNA片段为模板制备探针DNA经电泳后，用EB染色，切下DNA色带，加水后沸水浴使其变性，然后37℃（固定），再加其他试剂室温或37℃制备探针第38页，共79页，星期日，2025年，2月5日（二）RNA探针的制备（体外转录法）第39页，共79页，星期日，2025年，2月5日四、标记物纯化标记物纯化就是除去未标记的同位素或非同位素产物并非所有探针都需纯化，通常用于膜杂交的探针不需纯化，而用于原位杂交的探针则需要纯化。常用的纯化方法有萃取/沉淀法、层析法、离心法和电泳法等第40页，共79页，星期日，2025年，2月5日（一）EtOH沉淀法①加1μl糖原溶液（20mg/ml）到含探针的试管中，混匀②加2~3倍体积冷EtOH，低温沉淀，离心分离沉淀，并用少量70%冷EtOH洗涤③干燥的沉淀物溶于TE缓冲液中，低温贮存第41页，共79页，星期日，2025年，2月5日（二）层析法SepharoseCL-4B柱层析层析结果用PAGE检测SephadexG-50或