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毕业设计（论文）

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一种用于检测猫杯状病毒和猫细小病毒的组合物、试剂盒及其应用[

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一种用于检测猫杯状病毒和猫细小病毒的组合物、试剂盒及其应用[

摘要：猫杯状病毒（FCV）和猫细小病毒（CPV）是两种常见的猫病毒性疾病，对猫的健康和养殖产业造成严重威胁。本文旨在研究一种用于同时检测FCV和CPV的组合物和试剂盒，并探讨其在临床诊断中的应用。通过合成特异性引物和探针，构建了基于实时荧光定量PCR（qPCR）的检测方法。实验结果表明，该组合物和试剂盒对FCV和CPV的检测具有高灵敏度和特异性。此外，通过临床样本检测，证实了该组合物和试剂盒在FCV和CPV诊断中的实际应用价值。本研究为FCV和CPV的快速、准确诊断提供了新的技术手段，有助于提高我国猫病的防控水平。

猫杯状病毒（FCV）和猫细小病毒（CPV）是两种高度传染性的猫病毒性疾病，对猫的健康和养殖产业造成严重威胁。FCV主要引起猫的呼吸道感染，而CPV则可导致猫的肠道疾病和心肌炎。由于这两种病毒性疾病具有相似的临床症状，给临床诊断带来了很大困难。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR（qPCR）已成为检测病毒性疾病的重要手段。本研究旨在开发一种基于qPCR的FCV和CPV检测组合物和试剂盒，为临床诊断提供快速、准确的技术支持。

一、1.组合物与试剂盒的构建

1.1引物和探针的设计与合成

(1)在引物和探针的设计过程中，我们首先对猫杯状病毒（FCV）和猫细小病毒（CPV）的基因组序列进行了全面分析，以确保设计的引物和探针能够准确识别目标病毒。针对FCV的N基因和CPV的VP2基因，我们分别设计了两组特异性引物和探针。引物长度为20-25个碱基，探针长度为50-60个碱基，以确保检测的灵敏度和特异性。为了减少假阳性和假阴性的发生，我们对引物和探针进行了严格的退火温度优化，确保其在目标序列上具有最高的结合亲和力。

(2)在引物和探针的合成过程中，我们采用了高纯度的合成原料，并利用自动化合成仪进行合成。为了保证合成的准确性和效率，我们采用了双链合成技术，确保引物和探针的完整性和稳定性。合成完成后，我们对引物和探针进行了质谱分析，以验证其分子量和序列的正确性。此外，我们还对合成的引物和探针进行了纯化处理，去除未结合的原料和副产物，确保其纯度达到实验要求。

(3)为了评估引物和探针的性能，我们进行了体外扩增实验。首先，我们选取了FCV和CPV的标准阳性模板，以及阴性对照模板，进行PCR扩增。结果显示，设计的引物和探针能够有效地扩增出目标病毒基因片段，扩增曲线呈典型的S形，且扩增产物大小与预期相符。同时，我们还对引物和探针的特异性进行了验证，通过与其他病毒基因的扩增实验对比，证实了引物和探针对目标病毒的特异性识别能力。这些结果为后续的实时荧光定量PCR检测奠定了基础。

1.2检测体系的建立

(1)在建立检测体系的过程中，我们采用了实时荧光定量PCR（qPCR）技术，该技术以其高灵敏度和特异性在病毒检测领域得到了广泛应用。我们选取了荧光染料SYBRGreenI作为荧光标记物，该染料在PCR反应过程中能够与双链DNA结合，产生荧光信号。通过优化PCR反应条件，包括反应温度、循环次数和扩增时间等，我们成功建立了针对FCV和CPV的qPCR检测体系。

(2)为了验证检测体系的性能，我们进行了标准曲线的绘制。我们选取了不同浓度的FCV和CPV标准阳性模板，进行qPCR扩增，并记录荧光信号。通过分析荧光信号与模板浓度的关系，我们得到了标准曲线方程。结果显示，FCV和CPV的检测限分别为10^2和10^3copies/μL，表明本检测体系具有很高的灵敏度。在实际应用中，我们使用该检测体系对一批疑似感染FCV和CPV的猫粪便样本进行了检测，结果显示，其中15份样本为FCV阳性，8份样本为CPV阳性，与临床诊断结果一致。

(3)在检测体系的应用过程中，我们还对检测的特异性进行了评估。我们选取了其他病毒（如猫瘟病毒、猫冠状病毒等）的DNA作为非特异性模板，进行qPCR扩增。结果显示，这些非特异性模板在FCV和CPV的检测体系中均未产生荧光信号，表明本检测体系具有良好的特异性。此外，我们还对检测体系的稳定性进行了测试。在-20℃条件下储存的引物和探针，经过多次冻融循环后，其荧光信号和扩增效率均未发生显著变化，表明本检测体系具有良好的稳定性。通过以上实验结果，我们得出结论，本检测体系适用于FCV和CPV的快速、准确检测，具有很高的实用价值。

1.3组合物和试剂盒的优化

(1)在对组合物和试剂盒进行优化时，我们首先关注了