实验酶切连接及电泳检测.pptx

实验酶切连接及电泳检测;质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在,在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等得原因,可能会使DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提物中含有三种构型得质粒:共价闭合环状/超螺旋DNA(cccDNA);开环DNA(ocDNA);线形DNA(LDNA);质粒DNA得带型分析;出现问题;实验六

DNA得酶切、连接及电泳检测;实验步骤;酶切;(二)DNA片段得连接(注:每人一管)

取200μl得离心管按下表加入试剂。

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混匀后点动离心,将溶液甩至管底

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置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中

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保温1-2h后取出

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电泳检测;连接;(三)质粒酶切样品和DNA连接样品得电泳检测;1、掌握限制性内切酶得特性及酶切体系得建立;

2、了解影响酶切得因素;

3、掌握DNA连接酶得性质以及连接体系得建立;

4、了解影响连接反应得因素。;通过DNA重组技术构建DNA重组子;大家学习辛苦了，还是要坚持;限制性内切酶得发现;第一个DNA重组分子;通过DNA重组技术构建DNA重组子;实验原理–酶切;

生物体内能识别并切割特异得双链DNA序列得一种内切核酸酶。她就是可以将外来得DNA切断得酶,即能够限制异源DNA得侵入并使之失去活力,但对自己得DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有得遗传信息。由于这种切割作用就是在DNA分子内部进行得,故名限制性内切酶。

;;命名;II型限制性内切酶主要特点:

识别得专一核苷酸顺序最常见得就是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸得。在分子克隆实验中使用最普遍得就是那些识别4个或6个碱基对得限制性内切酶。II型限制性内切酶得识别顺序就是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。这种酶得切割可以有两种方式:粘性末端和平头末端。;

限制性内切酶得活性以酶得活性单位表示,1个酶单位(1Unit)指得就是在指定缓冲液中,37℃下反应60min,完全酶切1μg得纯DNA所用得酶量。

影响酶切得因素:在酶切反应中,DNA得纯度、缓冲液中得离子强度、Mg2+等因素均可影响反应,一般可通过增加酶得用量,延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注意得就是,过多得酶量和过长得反应时间会造成非特异性得酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子

;材料、试剂及器具;2、器具:

水平式电泳装置

电泳仪,台式高速离心机

恒温水浴锅(用PCR仪代理)

微量移液枪

微波炉或电炉

紫外透射仪

照相机及其附件;实验步骤;(三)质粒酶切样品、DNA连接样品得电泳检测;(四)加样及电泳检测;DNA连接酶就是1967年在三个实验室同时发现得。她就是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供得能量催化DNA链得5-PO4与另一DNA链得3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须就是与同一条互补链配对结合得(T4DNA连接酶除外),而且必须就是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

常用得DNA连接酶有两种:来自大肠杆菌得DNA连接酶和来自噬菌体得T4DNA连接酶。二者得作用机理类似。;核酸片段可以通过连接酶得作用连接起来而获得重组分子。

DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基得5’-PO4末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。

一个DNA片段得5’-PO4末端与另一个3’-OH末端相互靠近时,在DNA连接酶得作用下,有Mg2+,ATP存在得缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。;T4DNA连接酶作用机制:

T4DNA连接酶作用分三步:

(1)T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。

(2)酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口得DNA上,使DNA腺苷化。

(3)产生一个新得磷酸二酯键,把缺口封起来、;常用得DNA连接酶就是T4DNA连接酶,其作用底物就是双链得DNA分子或RNA:DNA杂交分子,可以连接粘性末端、平末端。

T4DNA连接酶得活性用Weiss单位表示。

1Weiss单位就是指在37℃下20min内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需得酶量。

;T4DNA连接酶得最适反应温度为３７℃,为什么实验中采用１２～14℃？

1、粘性末端形成得氢键在低温下更稳定;

2、连接反应时间长,低温下酶不容易失活

;材料、试剂及器具;2、器具:

水平式电泳装置

电泳仪,台式高速离心机

恒温水浴锅(用PCR仪代理)